李小蘭，張 瑞，郝蘭蘭，王 鴻，2，*

(1.甘肅農業(yè)大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省農業(yè)科學院 林果花卉研究所，甘肅 蘭州 730070)

植物經常遭受各種生物和非生物脅迫，如鹽、干旱、寒冷、病原體和害蟲等，這些脅迫直接或間接地影響植物的生長發(fā)育，從而影響植物的生產。由于植物的許多代謝途徑都是在轉錄水平上調控的，轉錄因子通過與特定的順式啟動子元件結合，在植物應對這些脅迫的響應中起著重要作用。近年來轉錄因子越來越受到人們的關注，NAC轉錄因子對植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應答均有重要調節(jié)功能，改變NAC轉錄因子的表達量，不僅可以緩解果實采收后的衰老，而且可以有效抵御各種非生物脅迫。

NAC轉錄因子家族是植物在應對不利環(huán)境脅迫中起重要作用的最大的特異性基因家族之一。NAC家族基因的名稱來源于3個轉錄因子：NAM(no apical meristem)、ATAF1/2和CUC2(cup-shaped cotyledon)。NAC特定結構域位于NAC家族蛋白的N端區(qū)域，可分為5個亞結構域(A～E)，亞域C提供NAC轉錄因子的DNA結合能力。NAC蛋白的C端除具有保守的NAC結構域外，還具有一個轉錄激活或抑制活性的高度分化的轉錄調控區(qū)域，使NAC轉錄因子具有調控植物生長發(fā)育、果實成熟、葉片衰老、激素信號，以及生物和非生物脅迫應答的功能。由于NAC蛋白在植物生長發(fā)育過程中的重要作用，不少研究已經對擬南芥、水稻、大豆、白梨、苦蕎、白楊、葡萄、梅花、西瓜等植物進行了全基因組分析。NAC蛋白在植物中的一個重要調控作用是提高植物的抗寒性，已有研究表明，在構樹、蓮藕、木薯、西瓜和白梨中都發(fā)現了數量不等的NAC抗寒基因。近年來，Zhuo等在梅花中發(fā)現了15個NAC抗寒基因。但是，目前為止對NAC基因在桃抗寒方面的作用尚未見系統(tǒng)報道。

桃(L.)是薔薇科李屬桃亞屬果樹，是我國重要的落葉果樹之一，其果實色、香、味、質俱佳，具有很高的經濟和營養(yǎng)價值，近年來頗受人們的喜愛。溫度是影響桃產量和地理分布的關鍵因素。我國桃種植的北線是39°N～40°N，這些地區(qū)周期性發(fā)生凍害，對桃產量產生嚴重影響。桃中與抗寒相關的NAC轉錄因子的研究還比較少。武肖琦利用反轉錄技術獲得與桃果實發(fā)育相關的72基因，在番茄中過表達72可以促進轉基因番茄的果實發(fā)育，加速果實成熟。因此，挖掘抗寒相關基因，為桃抗寒育種提供新的候選基因，對桃產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。本研究根據桃基因組提供的信息，對桃NAC基因數量進行了鑒定，并對其基因結構、基序組成、染色體定位，以及與擬南芥的進化關系等進行了研究。另外，采用實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)分析了16個基因在低溫處理不同時間的表達模式。

1 材料與方法

1.1 材料

以桃品種丁家壩為材料，于2020年9月下旬在甘肅省農業(yè)科學院桃園采集12枝直徑(1±0.2)cm、長短相同、朝北直立生長的一年生帶葉枝條。將枝條置于室溫水培24 h，隨后將枝條隨機分為4組，用保鮮袋密封，于4 ℃培養(yǎng)箱中進行低溫誘導。分別在0、2、6、12 h隨機選取一組枝條采集葉片，選取從上往下數第7到第9片葉作為實驗材料，立即用液氮冷凍，-80 ℃保存，用于后續(xù)實驗。每組3個枝條分別作為3個重復。

1.2 方法

1.2.1 桃基因組中NAC基因的鑒定

從擬南芥基因組數據庫中(TAIR)(http://www. arabidopsis.org/)下載擬南芥NAC家族基因的蛋白序列和CDS序列。在桃基因組數據庫中(GDR)(https://www.rosaceae.org/)下載桃基因注釋Excel文件，篩選結構域為PF02365和PF01849的基因，獲得桃NAC候選基因。進一步運用Pfam(https：//pfam.xfam.org/search)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)軟件確認桃NAC候選基因的保守結構域，最終獲得桃NAC家族基因(簡稱)。利用在線網站(https://web.expasy.org/protparam/)對篩選的桃NAC家族基因進行理化性質分析。

1.2.2 基因結構與保守基序分析

利用MEGA 6.0程序(http://www.megasoftware.net/mega.php)的鄰接法，使用蛋白序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap replications設置為1 000。使用MEME在線軟件(http：//meme-suite.org/tools/meme)對PpNAC蛋白序列特征進行分析，基序數量設置為8(motif1～motif8)。利用全長序列結合桃基因組注釋信息文件進行基因結構分析，同時利用TBtools對基因結構和保守基序進行可視化。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育和多序列比對

為了探究桃與擬南芥NACs的進化關系，采用Clustal W軟件對桃和擬南芥NAC蛋白序列進行比對，并利用MEGA 6.0程序的鄰接法(neighbor joining，NJ)(http://www.megasoftware.net/mega.php)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數設置為Poission模式、完全刪除和1 000次重復。利用DNAMAN軟件對蛋白序列進行多重比對。

1.2.4 染色體定位分析

根據基因在桃數據庫中的位置，用MG2C軟件(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)將所有基因定位到桃染色體上。

1.2.5 啟動子順式作用元件分析

使用TBtools軟件結合桃基因組文件和基因結構注釋信息文件提取基因轉錄起始位點上游2 000 bp的序列，使用Plant CARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)進行啟動子順式作用元件預測，最后利用TBtools進行可視化。

1.2.6 qRT-PCR

依據順式作用元件分析結果，選取16個含低溫響應和逆境應答元件較多的基因，使用DNAMAN設計家族基因特異性引物(表 1)，并在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。cDNA合成采用Prime Script RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)，并參照說明書進行。采用SYBR Green熒光染料法進行qRT-PCR反應，以作為內參基因。反應程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；60 ℃ 60 s；50 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。試驗進行3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 桃NAC基因的鑒定與理化性質

根據PF02365和PF01849結構域在桃基因注釋Excel文件中搜索，共篩選出119個桃NAC基因家族成員。根據以往研究中提出的命名方法，將119個桃NAC基因命名為001～119。這些基因的基本信息如表2所示，包括桃基因組數據庫中的注釋號、染色體位置、氨基酸數量、分子量和等電點(pI)。119個基因除119位于染色體骨架上之外，其余基因均定位在桃的8條染色體上；編碼的氨基酸數量在68(026)～862(PpNAC077)，平均氨基酸長度為352 aa；分子量為7.2(PpNAC026)～96.1(PpNAC077)ku，平均分子量為39.8ku；等電點在4.3(PpNAC019和PpNAC100)～9.5(PpNAC047)。

2.2 桃NAC基因家族的基因結構和保守基序分析

進化樹結果(圖1)顯示，119個被劃分為12個亞族(Ⅰ～Ⅻ)，每個亞族的成員數量為1～22。其中，第Ⅹ亞族成員數量最少，只包含1個基因；第Ⅰ亞族成員數量最多，包含22個基因。為了鑒定的結構多樣性，分析了單個基因序列中的外顯子-內含子數量。結果(圖1-B)顯示：19個基因沒有內含子，除026外均處于第Ⅷ和第Ⅸ亞族中；其余基因至少包含1個內含子(005、017、023、034、069、071、086、091、092、095)，最多包含9個內含子(029)。同一亞族內的基因內含子數量和長度基本一致，例如，第Ⅵ和第Ⅶ亞族中除了少數基因外，大多數基因都含有2個內含子，第Ⅷ和第Ⅸ亞族中多數基因不含內含子。

表1 引物信息

表2 桃NAC家族基因成員的相關信息

續(xù)表2 Continued Table 2

續(xù)表2 Continued Table 2

由圖1-A可以看出，motif1+motif8、motif5、motif4+motif2、motif6+motif3和motif7分別組成了NAC的子結構域A、B、C、D和E。進一步分析發(fā)現，大部分保守基序位于NAC結構域的N端區(qū)域，表明這些保守基序對的功能具有重要意義。從出現頻率來看，motif1、motif3和motif7出現頻率最高，幾乎覆蓋了從Ⅰ到Ⅻ的所有亞族，表明motif1、motif3和motif7是的重要保守基序。此外，聚集在同一亞族中的基序組成和排列順序基本相同，推測特定的基序組成和排列順序可能與不同亞族的特定功能有關。

2.3 PpNACs多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

對119個PpNACs的保守結構域進行分析可知，NAC結構域的子域A、C和D是保守的，而B和E是發(fā)散的(圖2)。詳細檢查子域B和E發(fā)現，Ⅻ亞族序列的子域B和E都不保守。由于子域A、C、和D保守，推測他們在NAC家族基因的功能中發(fā)揮重要作用，發(fā)散的子域B和E可能與NAC家族基因的特定功能有關。

CDS中間的區(qū)域是內含子。The region in the middle of the CDS was intron.圖1 PpNAC基因的基序分析(A)和基因結構(B)Fig.1 Gene structure and motif analysis of PpNACs in peach

圖2 桃NAC的多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of NAC in peach

通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析將桃和擬南芥的NAC分為18個亞族(a～r)(圖3)。119個PpNACs分布在除亞族c、d和h外的15個亞族上，每個亞族包含1～23個成員。其中，p亞族包含成員數量最少，只包含1個，e亞族包含成員數量最多，有23個成員。進一步分析發(fā)現，擬南芥與桃之間存在一些密切相關的NACs(比如PpNAC005、PpNAC080和ANAC006，PpNAC118和ANAC74等)，這些PpNACs可能與擬南芥的同源ANACs具有相似的功能。

2.4 PpNACs基因的染色體定位分析

根據119個基因在桃基因組數據庫中的位置，使用MapChart軟件繪制了其在染色體上的分布情況，其中，118個基因不均勻地分布在1到8號染色體上，119被定位在未定位的支架上(scaffold-53)(圖4)。2號染色體上分布的基因數量最多，占比21%；其次是4號染色體，占比18%；3號、5號和8號染色體分布的基因數量最少，分別包含8、11和11個基因。

☆，擬南芥；★，桃?！?，Arabidopsis; ★， Peach.圖3 桃和擬南芥NAC家族成員系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NAC family members in peach and Arabidopsis

2.5 PpNACs的順式作用元件

在桃NAC家族基因起始密碼子上游2 000 bp序列中共篩選出9種類型的順勢調控元件：(1)脫落酸響應原件298個；(2)光響應原件1331個；(3)茉莉酸甲酯響應原件382個；(4)防御和應激響應原件52個；(5)水楊酸響應原件84個；(6)低溫響應原件92個；(7)生長素響應原件103個；(8)類黃酮響應原件10個；(9)赤霉素響應原件121個(圖5)。推測NAC家族基因在桃應對生物與非生物脅迫響應發(fā)揮重要作用。

2.6 PpNACs在低溫脅迫下的表達模式

挑選16個含低溫響應和逆境應答元件較多的基因進行qRT-PCR分析，結果(圖6)表明，4℃低溫脅迫下，所選的16個基因的相對表達量在低溫脅迫不同時間均表現為上調；015、037、048和064在低溫脅迫2 h時，與對照相比表達量上調不明顯；與低溫處理2 h相比，048、052、077和117在低溫處理6 h時表達量上調不顯著；在低溫處理12 h時，所有的基因相對表達量與對照相比均顯著上調。表明桃NAC轉錄因子家族可能在桃的抗寒過程中發(fā)揮重要功能，并且需要在一定時間的低溫脅迫后才能顯著上調表達。

3 結論與討論

植物特異性NAC轉錄因子是植物中最大的轉錄調控家族之一，在植物的生長發(fā)育調控和逆境響應中發(fā)揮重要作用。由于NAC基因在植物中的重要作用，許多NAC轉錄因子已經在擬南芥、水稻、楊樹和甘蔗等模式植物和非模式植物中進行了全基因組鑒定和功能表征。本研究通過全基因組分析，共鑒定了119個基因，并將其命名為001～119?；蚣易宄蓡T數量多于馬鈴薯(110個)、擬南芥(105個)、大豆(101個)、木薯(96個)、葡萄(79個)和甘蔗(88個)，少于水稻(151個)和楊樹(163個)，成員數量的大小差異可能是由于各物種進化和分化過程中的全基因組多倍體事件造成的。

圖4 桃NAC家族基因的染色體定位Fig.4 Chromosomal localization of NAC family genes in peach

圖5 桃NAC家族基因的順式作用元件Fig.5 Cis-acting elements of NAC family genes in peach

PpNAC家族成員在基因長度、蛋白質分子量和等電點等方面存在較大差異，但基因結構相對保守。根據家族成員聚類關系，將所有的蛋白分為12個亞族。同一亞族的成員關系密切，具有相似的外顯子/內含子結構和位置，推測可能在桃的生長發(fā)育和逆境響應中具有相似的功能，這與前人對白梨和亞洲梨的研究結果基本一致；但同一亞族成員之間也存在一定的差異，如外顯子的大小、相對位置和數量等，例如，第Ⅱ亞族中077的外顯子數量多于同一亞族中其余成員數量，并且同一亞族中094的外顯子數量明顯多于其他成員。這一結果可能是由于進化過程中基因片段的剪接或插入，產生了新的基因功能所致。此外，同一亞族大多數成員的motif數量和排列順序基本相似，表明這些蛋白質具有保守功能，這與NACs相關功能被很好的保存的結果相印證。由于擬南芥的NACs基因研究較深入，根據擬南芥NACs基因的同源性預測PpNACs的功能和進化關系，所有的NAC蛋白被分為18個亞族(a-r)，并且聚類在同一分支中的基因具有功能多樣性，例如，31、92和98屬于q亞族，它們不僅與植物衰老和頂端分生組織的形成有關，而且與器官的形成有關；值得注意的是，c、d和h亞族中沒有包含PpNAC成員，而b、e和m亞族中沒有發(fā)現任何擬南芥的NAC成員，這表明NAC在各個物種中的進化存在差異。氨基酸序列比對和保守基序分析發(fā)現，motif1+motif8、motif6、motif3+motif4、motif2+motif5和motif7分別代表NAC結構域的子域A、B、C、D和E。大多數桃NAC蛋白同時包含motif1-motif8基序，驗證了NAC蛋白的高度保守性，但也有幾個亞族的蛋白僅包含其中幾種motifs，表明該亞族的基因可能具有不同的功能，這與苦蕎中的研究結果一致。順式作用元件分析表明，這些序列主要包含9類原件，占比較大的是光響應原件、逆境響應原件、低溫響應原件和類黃酮響應原件，這些元件在桃生長發(fā)育和應對逆境脅迫過程中起到至關重要的作用。16個含低溫響應與逆境應答元件較多的基因在低溫脅迫下明顯上調，猜測其可能參與桃對低溫脅迫的響應。

圖6 低溫脅迫下桃NAC基因的表達水平Fig.6 Expression levelof PpNAC genes in peach under low temperature stress

綜上，基因在桃對低溫脅迫的響應中發(fā)揮了重要作用，因此可能成為桃抗寒性相關的候選基因。