余艷玲，羅洪林，羅 輝，馮鵬霏，潘傳燕，宋漫玲，肖 蕊，張永德，*

(1.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021； 2.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

脊椎動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)由骨骼與肌肉組成，骨骼肌在產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)、支撐骨骼、維持姿勢(shì)、保護(hù)身體和產(chǎn)熱等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)由多種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，在此過(guò)程中，生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors， MRF)在骨骼肌的發(fā)育及調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。MRF被認(rèn)為是調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育分化的分子開(kāi)關(guān)，其功能與活性可以決定整個(gè)細(xì)胞譜系的命運(yùn)。MRF家族由4種肌肉特異性蛋白質(zhì)組成，包括生肌決定因子(myogenic differentiation，)、生肌調(diào)節(jié)因子6(myogenic regulatory factor 6，6)(或稱(chēng)4)、生肌調(diào)節(jié)因子5(5)和肌細(xì)胞生成素(myogenin，)。它們?cè)诩∪獍l(fā)育譜系的多個(gè)點(diǎn)起作用，通過(guò)調(diào)節(jié)前體細(xì)胞的增殖、不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞周期停滯來(lái)協(xié)同建立骨骼肌表型，然后調(diào)節(jié)肌節(jié)和肌肉特異基因的激活，以促進(jìn)分化和肌節(jié)的組裝。在發(fā)育過(guò)程中，5和被視為成肌決定因素，控制胚胎中肌細(xì)胞的確定和分化，以及肌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和再生，Myf6與MyoG是肌源性分化因子，在Myf5和MyoD的下游發(fā)揮作用，它們有助于成肌細(xì)胞的分化，而Myf6在決定和分化水平上都發(fā)揮作用。

MRF家族蛋白質(zhì)主要包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一個(gè)是與螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(helix-loop-helix， HLH)相連的基本域，合稱(chēng)為bHLH，第二個(gè)是半胱氨酸/組氨酸結(jié)構(gòu)域，位于靠近bHLH的N端，第三個(gè)是富含絲氨酸/蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域，位于C末端附近，而bHLH結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是肌生成激活的主要貢獻(xiàn)者。HLH蛋白質(zhì)有7類(lèi)，MRF被認(rèn)為是Ⅱ類(lèi)蛋白質(zhì)，因?yàn)槠浔磉_(dá)僅限于單一組織類(lèi)型(骨骼肌)。bHLH結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合DNA中稱(chēng)為E-box(CANNTG)的特定序列，與E-box的結(jié)合受到表觀遺傳的調(diào)控。HLH結(jié)構(gòu)域允許與普遍存在的Ⅰ類(lèi)bHLH E蛋白質(zhì)(包括E12、E47、HEB/HTF4和E2-2/ITF-2)進(jìn)行同二聚或異二聚，從而進(jìn)行肌生成。

骨骼肌的基本結(jié)構(gòu)是在胚胎發(fā)生過(guò)程中形成的。盡管MRF基因在胚胎肌發(fā)生過(guò)程中僅在肌細(xì)胞中表達(dá)，但在蛋白質(zhì)水平以及表達(dá)的時(shí)間和階段上存在內(nèi)在差異，反映了MRF在肌細(xì)胞分化中的潛在特異性。這些差異突出了每個(gè)MRF基因在蛋白質(zhì)水平上對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)及其相互作用伙伴的特異性反應(yīng)，迄今為止，這方面的研究還十分薄弱。

卵形鯧鲹()是我國(guó)海水養(yǎng)殖的名貴魚(yú)類(lèi)，也是適合我國(guó)近、遠(yuǎn)海集約化養(yǎng)殖的重要品種之一，近些年在我國(guó)南部沿海地區(qū)發(fā)展迅速。隨著卵形鯧鲹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，種質(zhì)退化現(xiàn)象逐漸顯露，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)速率下降、群體整齊度低、畸形、抗病力低、病害發(fā)生頻繁、魚(yú)苗死亡率高等。因此，開(kāi)展卵形鯧鲹生長(zhǎng)相關(guān)基因的研究，對(duì)其產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展意義重大。MRF家族基因是動(dòng)物肌肉發(fā)育中的重要調(diào)控因子，了解MRF基因在胚胎發(fā)育中的表達(dá)，對(duì)了解卵形鯧鲹肌肉發(fā)育特征及生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。然而，目前對(duì)卵形鯧鲹MRF基因家族尚不了解，其在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用及其表達(dá)模式尚不清楚。本研究基于全基因組序列，對(duì)卵形鯧鲹的MRF基因家族進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其在胚胎發(fā)育各階段中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，旨在為進(jìn)一步研究MRF家族基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用及其肌肉組織的發(fā)生發(fā)展等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

卵形鯧鲹受精卵取自深圳南澳鎮(zhèn)大鵬灣海域人工養(yǎng)殖群體，待其產(chǎn)卵與自然受精后，即刻撈起受精卵，置于1 000 L的孵化桶孵化，孵化溫度為26～31 ℃。顯微鏡下觀察確定胚胎所處的發(fā)育階段，對(duì)受精卵(OSP)、8細(xì)胞期(8-Cell)、16細(xì)胞期(16-Cell)、64細(xì)胞期(64-Cell)、高囊胚期(HBS)、原腸早期(EGS)、原腸中期(MGS)、原腸末期(LGS)、胚體形成期(EFS)、眼囊期(OPVS)、耳囊期(OTVS)、心臟跳動(dòng)期(HPS)、晶體出現(xiàn)期(FELS)共13個(gè)發(fā)育階段的胚胎分別取樣，每個(gè)階段取樣品3份，液氮保存。

RNAsimple提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技(北京)有限公司；HiScriptⅢ RT SuperMix、ChamQ SYBR qPCR Mix、AceTaqMaster Mix均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 MRF基因家族的鑒定與理化特性分析

卵形鯧鲹基因組由本單位測(cè)序組裝獲得(PRJNA574895)。MRF基因家族采用兩種方法鑒定，一種是從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了鲹形目MRF家族30個(gè)蛋白質(zhì)序列，這些序列被用作查詢序列以進(jìn)行BLASTp搜索(E值<10)，使用blastp程序?qū)β研析K鲹所有蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源分析。然后，手動(dòng)去除重復(fù)的基因，并獲得原始候選基因。另一種方法是從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)下載MRF基因家族序列特征文件(PF01586)，采用hmmer 3.1軟件，根據(jù)序列特征文件PF01586識(shí)別卵形鯧鲹MRF家族基因的蛋白質(zhì)序列，其中e值小于-20。獲得的候選序列通過(guò)SMART(http://smart.embl.de/)、NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)與pfam數(shù)據(jù)庫(kù)手動(dòng)確認(rèn)結(jié)構(gòu)域，確定候選蛋白質(zhì)序列。采用Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)MRF家族蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)和疏水性均值(GRAVY)等理化特性進(jìn)行分析；采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.3 基因結(jié)構(gòu)、motif預(yù)測(cè)及染色體定位分析

通過(guò)基因組注釋文件獲得MRF家族各基因的5′-UTR、3′-UTR、外顯子、內(nèi)含子位置及長(zhǎng)度等信息，采用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖，利用MEME 5.1.1(http://meme-suite.org/tools/meme)在線工具對(duì)MRF家族基因的基序(motif)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，基序的最短長(zhǎng)度設(shè)為10，最大長(zhǎng)度為100，利用TBtools 0.66軟件作圖。通過(guò)基因組注釋文件提取基因在染色體中的位置，采用Samtools 1.10軟件分析獲得各染色體的長(zhǎng)度，Mapchart 2.32軟件進(jìn)行染色體繪圖。

1.4 序列比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

采用Mega X軟件的ClustalW程序?qū)β研析K鲹MRF家族基因全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算基因間的遺傳距離，并應(yīng)用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，選擇Poisson模型，采用“bootstrap”1 000次自舉檢測(cè)表明各分支的置信度。從Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)下載高體鰤()、黃尾鰤()、大菱鲆()、半滑舌鰨()4個(gè)物種的基因組序列文件，采用與卵形鯧鲹同樣的方法進(jìn)行基因家族鑒定，然后采用最大似然(ML)法對(duì)高體鰤、黃尾鰤、大菱鲆、半滑舌鰨與卵形鯧鲹5種魚(yú)類(lèi)的MRF家族基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建ML系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，采用Poisson模型，對(duì)空位采用完全刪除(complete deletion)，并用“bootstrap”1 000次自舉檢測(cè)表明各分支的置信度。

1.5 RNA分離與qRT-PCR分析

通過(guò)天根生物RNAsimple提取試劑盒分離卵形鯧鲹不同發(fā)育階段的胚胎組織總RNA。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整度，采用NanoDrop One檢測(cè)RNA的濃度。對(duì)完整性較好的RNA，根據(jù)南京諾唯贊Hiscript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。以18S rRNA作為內(nèi)參基因，采用諾唯贊2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。15 μL反應(yīng)體系中包含ChamQ Universal SYBR qPCR Mix 7.5 μL，上下游引物(10 μmol·L)(表1)各0.3 μL，cDNA模板1.2 μL，ddHO 5.7 μL。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每種MRF基因的PCR產(chǎn)物均通過(guò)測(cè)序以確認(rèn)序列的準(zhǔn)確性。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，通過(guò)Duncan多重比較分析各組織間的差異顯著性。

表1 卵形鯧鲹MRF家族基因qRT-PCR引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 MRF基因家族的鑒定與理化特性分析

通過(guò)對(duì)卵形鯧鲹MRF基因家族的鑒定，共獲得了5個(gè)基因。經(jīng)基因注釋分析，確認(rèn)5個(gè)基因分別為1、2、5、6與。根據(jù)氨基酸序列，對(duì)MRF家族蛋白質(zhì)的理化特性進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析(表2)，卵形鯧鲹MRF家族蛋白質(zhì)長(zhǎng)度介于231～297 aa，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量介于25 542.27～32 206.38 u，其中ToMyf6與ToMyoD1分別對(duì)應(yīng)最小和最大的蛋白質(zhì)。所有MRF蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在5.33～6.33，其中ToMyoD1與ToMyoG蛋白質(zhì)分別具有最小和最大的等電點(diǎn)，5個(gè)蛋白質(zhì)均為酸性蛋白質(zhì)。GRAVY的值介于-0.591～-0.849，表明這些蛋白質(zhì)均為親水性蛋白。5個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性指數(shù)介于65.35～89.12，表明這些蛋白質(zhì)均屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖1)，卵形鯧鲹MRF家族蛋白質(zhì)均呈現(xiàn)典型的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，兩螺旋結(jié)構(gòu)一短一長(zhǎng)，呈約140°的夾角。

2.2 基因結(jié)構(gòu)及motif預(yù)測(cè)分析

對(duì)卵形鯧鲹MRF家族5個(gè)基因的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，5個(gè)基因都由外顯子、內(nèi)含子和 UTR 區(qū)組成，但序列信息中5與6缺少5′-UTR，1缺少3′-UTR。除6可能包含4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子外；其余4個(gè)成員均包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。

表2 卵形鯧鲹MRF家族蛋白質(zhì)的理化特性

圖1 卵形鯧鲹MRF家族蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1 Tertiary structure of MRF family proteins in T. ovatus

圖2 卵形鯧鲹MRF家族基因的結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of the T. ovatus MYF family genes

采用SMART、NCBI CDD與pfam三大數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)卵形鯧鲹MRF家族5個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域確認(rèn)，結(jié)果顯示，5個(gè)蛋白質(zhì)均存在BASIC結(jié)構(gòu)域和HLH結(jié)構(gòu)域(圖3-a)，其中HLH結(jié)構(gòu)域較為保守，而MYF5結(jié)構(gòu)域僅在1、2與5中保守，而在6與中卻不保守。為了進(jìn)一步鑒定其保守 結(jié)構(gòu)域，采用MEME工具分析了MRF家族5個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，總共獲得了6個(gè)保守的基序(motif)(圖3-a、b)，每個(gè)基因包含3～5個(gè)基序。其中基序1包含該家族基因典型的HLH結(jié)構(gòu)域，與基序4一樣均在5個(gè)基因中出現(xiàn)，基序2、基序3僅在1與2中出現(xiàn)，基因缺少基序5，基序6僅在5與中出現(xiàn)。

2.3 MRF家族基因的染色體定位分析

a，MRF家族成員的結(jié)構(gòu)域及保守基序位置；b，MRF家族成員的保守基序組成。a， Domain and conserved motif position of MRF family genes; b， Conserved motif composition of MRF family genes.圖3 卵形鯧鲹MRF基因家族的結(jié)構(gòu)域及保守基序Fig.3 Domain and conserved motif of MRF gene family in T.ovatus

染色體定位分析顯示，MRF家族基因定位于卵形鯧鲹4對(duì)染色體上(圖4)，其中2基因定位于1號(hào)染色體，基因位于2號(hào)染色體，1基因位于9號(hào)染色體，而5與6基因則均位于22號(hào)染色體，兩基因位置相連，中間未檢測(cè)到其他基因的存在。

2.4 序列比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)卵形鯧鲹MRF家族5個(gè)基因進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建NJ聚類(lèi)樹(shù)(圖5)，結(jié)果顯示，5個(gè)基因的同源性在38.89%～68.34%，其中1與2基因的同源性最高，為68.34%，其遺傳距離也最近，為0.351 8。而與1、6

圖4 MRF家族基因在卵形鯧鲹染色體上的分布Fig.4 Chromosome distribution of MRF family genes in T. ovatus

圖5 卵形鯧鲹MRF家族基因NJ聚類(lèi)樹(shù)Fig.5 MRF family gene NJ clustering tree of T. ovatus

兩個(gè)基因的同源性最小，均為38.89%，與1之間遺傳距離最大，為1.032 2。聚類(lèi)樹(shù)顯示，1、2與5聚為一支，而6與聚為另一支。

對(duì)高體鰤、黃尾鰤、大菱鲆與半滑舌鰨4種魚(yú)類(lèi)MRF家族基因進(jìn)行鑒定，共獲得20個(gè)基因，每種魚(yú)類(lèi)5個(gè)基因，經(jīng)基因注釋分析，確認(rèn)5個(gè)基因分別為1、2、5、6、(表3)。將卵形鯧鲹與上述4種魚(yú)類(lèi)MRF家族基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。25個(gè)基因共聚為3個(gè)大分支(圖6)，其中1與2基因聚為一支，5獨(dú)立成為一支，兩分支具有較近的遺傳距離，而6與聚為一支。

表3 四種魚(yú)類(lèi)MRF家族基因信息

圖6 5種魚(yú)類(lèi)MRF家族基因編碼的蛋白質(zhì)的ML系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of MRF family proteins in five fish species

2.5 不同胚胎發(fā)育時(shí)期MRF家族基因的表達(dá)

利用qRT-PCR研究卵形鯧鲹MRF家族基因在13個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)情況，經(jīng)基因測(cè)序確認(rèn)所分析的基因即為MRF家族基因。其中1、2、5與6基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式較相似，從受精卵到原腸中期的7個(gè)時(shí)期表達(dá)量較低，而從原腸末期到孵化期的表達(dá)量迅速升高，且均顯著高于前7個(gè)時(shí)期(<0.05)。的表達(dá)量在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在受精卵到胚體形成期的前9個(gè)時(shí)期表達(dá)量極低，而在眼囊期、耳囊期與心臟跳動(dòng)期3個(gè)時(shí)期表達(dá)量迅速升高，到晶體出現(xiàn)期其表達(dá)量又有所降低，但仍然高于前9個(gè)胚胎發(fā)育期(<0.05)(圖7)。

沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same letters meant the significant difference (P<0.05).圖7 MRF家族基因在卵形鯧鲹不同胚胎發(fā)育階段的表達(dá)Fig.7 Expression pattern of MRF family genes in different developmental stages of T. ovatus embryos

3 討論

脊椎動(dòng)物的肢體和軀干肌肉源自最早在體節(jié)中建立的成肌祖細(xì)胞，體節(jié)的背側(cè)域細(xì)胞發(fā)育成為生皮肌節(jié)，生皮肌節(jié)最后發(fā)育成真皮、骨骼肌以及血管平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞等。所有這些事件主要受MRF即、5、6和的控制，此過(guò)程在所有脊椎動(dòng)物中是高度保守的，其結(jié)構(gòu)也存在高度的相似性；但是魚(yú)類(lèi)的肌肉生長(zhǎng)還具有某些明顯的特征，如生長(zhǎng)不定、生長(zhǎng)速率和達(dá)到的最大尺寸存在種屬差異等。此外，魚(yú)類(lèi)MRF的表達(dá)容易受溫度等環(huán)境變量和魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)階段及性別等生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)，飼料中高濃度的大豆?jié)饪s蛋白質(zhì)替代水平或饑餓也會(huì)改變生肌調(diào)節(jié)因子家族的時(shí)空表達(dá)模式。因此，了解與肌發(fā)生相關(guān)的MRF的分子結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于深入了解魚(yú)類(lèi)肌肉發(fā)育的特征是必要的，并對(duì)提高魚(yú)類(lèi)肌肉的生長(zhǎng)、肉質(zhì)和總產(chǎn)量方面具有重要意義。本研究采用Blast與hmm模型兩種方法分別對(duì)卵形鯧鲹、高體鰤?mèng)~、黃尾鰤?mèng)~、大菱鲆與半滑舌鰨5種魚(yú)類(lèi)MRF家族基因進(jìn)行了鑒定，各鑒定出5個(gè)MRF家族基因，分別為1、2、5、6和，說(shuō)明在這些魚(yú)類(lèi)中MRF成員的數(shù)量是高度保守的。然而人類(lèi)與小鼠等高等動(dòng)物MRF家族基因成員中可能缺少2基因。在這些物種的進(jìn)化過(guò)程中，2基因可能發(fā)生了丟失，或被其他基因所替代。

一般相似度較高的序列，可能發(fā)揮相似的蛋白質(zhì)功能。對(duì)卵形鯧鲹5個(gè)基因的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，除6基因可能為4個(gè)外顯子，其余4個(gè)基因均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，基因組成高度相似。結(jié)構(gòu)域分析顯示，MRF家族基因編碼的蛋白質(zhì)存在3個(gè)結(jié)構(gòu)域：BASIC結(jié)構(gòu)域、HLH結(jié)構(gòu)域和MYF5結(jié)構(gòu)域。在所有的MRF基因編碼的蛋白質(zhì)中，均包含BASIC結(jié)構(gòu)域和HLH結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化上存在較高的保守性。其中HLH結(jié)構(gòu)域是最保守的結(jié)構(gòu)域，它定義了MRF家族，該結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在5個(gè)MRF基因之間同源性最高，序列間差異最?。坏荕YF5結(jié)構(gòu)域僅存在于1、2與5中，而6與卻不含有該結(jié)構(gòu)域。MRF家族基因成員之間結(jié)構(gòu)的差異，說(shuō)明其功能雖有相似性，但也存在差異，這種多樣性推動(dòng)了多基因家族的進(jìn)化，各基因的具體功能差異有待進(jìn)一步研究。卵形鯧鲹MRF家族基因結(jié)構(gòu)與其他脊椎動(dòng)物存在高度的相似性，說(shuō)明MRF家族基因在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的，其功能也可能是高度保守的。

卵形鯧鲹具有24對(duì)染色體，對(duì)卵形鯧鲹MRF基因在染色體上的定位分析表明，MRF家族基因定位于1號(hào)、2號(hào)、9號(hào)與22號(hào)染色體上，其中5與6均定位于22號(hào)染色體，且位于同一基因座，形成5-6簇，且具有廣泛重疊的共有調(diào)控元件，說(shuō)明這兩個(gè)基因可能具有密切的進(jìn)化關(guān)系。1與2基因序列具有高度的相似性，其基因的同源性為68.34%，暗示其在進(jìn)化中存在較密切的關(guān)系，基因功能也可能高度相似，但2個(gè)基因卻位于不同的染色體上(9號(hào)與1號(hào)染色體)。因此，1與2可能是由獨(dú)立的復(fù)制產(chǎn)生的，或可能在進(jìn)化的過(guò)程中整個(gè)基因組發(fā)生復(fù)制產(chǎn)生，但在某些物種內(nèi)2基因發(fā)生了丟失，或被其他基因所替代。

對(duì)5種魚(yú)類(lèi)MRF家族成員的序列比對(duì)及聚類(lèi)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25個(gè)MRF家族成員聚為3大分支，其中1與2基因聚為一支，5獨(dú)立成為一個(gè)分支，兩分支遺傳距離較近，而6與聚為第三分支。這些進(jìn)化分支具有較高的鄰近匹配性，進(jìn)化支內(nèi)的關(guān)系也被發(fā)現(xiàn)具有很高的匹配率。該結(jié)果表明，每個(gè)亞家族中的MRF基因可能經(jīng)歷了相同的進(jìn)化事件并具有相似的功能。在脊椎動(dòng)物中，MRF家族基因被分為兩個(gè)主要功能組：和5參與肌肉細(xì)胞的決定，發(fā)揮“早期”的功能，和6主要參與分化，一種被“早期”MRF激活的“晚期”功能，而與5較近的遺傳距離，以及6與較近的遺傳距離，均與這些基因的功能分類(lèi)相似。系統(tǒng)發(fā)育分析還表明，高體鰤與黃尾鰤MRF家族5個(gè)基因具有最高的序列同源性，遺傳距離最近，這兩種魚(yú)均為鰤屬()魚(yú)類(lèi)。卵形鯧鲹與高體鰤、黃尾鰤的遺傳距離也較近，而與半滑舌鰨和大菱鲆的遺傳距離則較遠(yuǎn)。半滑舌鰨和大菱鲆屬于鰈形目(Pleuronectiformes)魚(yú)類(lèi)，而卵形鯧鲹與高體鰤、黃尾鰤則均屬于鲹科(Carangidae)魚(yú)類(lèi)，具有更近的親緣關(guān)系。MRF家族基因的聚類(lèi)樹(shù)狀圖并不代表這些物種的進(jìn)化歷史，但與這些物種的系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)結(jié)果高度一致。

MRF家族基因是動(dòng)物肌肉發(fā)育過(guò)程中重要的正向調(diào)控因子，其在不同發(fā)育階段和組織中的分布存在差異。對(duì)卵形鯧鲹13個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期的研究結(jié)果表明，的表達(dá)量在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在受精卵到胚體形成期的前9個(gè)時(shí)期表達(dá)量極低，而在眼囊期、耳囊期與心臟跳動(dòng)期表達(dá)量迅速升高，到晶體出現(xiàn)期表達(dá)量又有所降低，直到孵化期均維持較低的表達(dá)量，但仍顯著高于受精卵到胚胎形成期(<0.05)，推測(cè)其可能在眼囊、耳囊與心臟跳動(dòng)期發(fā)揮主要的生肌調(diào)節(jié)作用，且在維持肌肉的形態(tài)或后續(xù)肌肉發(fā)育中仍發(fā)揮重要作用。對(duì)維持肌肉穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)肌細(xì)胞融合以決定肌肉纖維的數(shù)量和大小至關(guān)重要。楊建等對(duì)斑馬魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，基因在囊胚期和原腸胚期表達(dá)量很低，在體節(jié)期和咽囊期表達(dá)量迅速升高，并在孵化期開(kāi)始下降，其結(jié)果與本研究結(jié)果相似。其余4個(gè)基因1、2、5與6在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式則較相似，原腸中期前表達(dá)量較低，而從原腸末期到孵化期表達(dá)量迅速升高，這暗示、5與6基因從原腸末期開(kāi)始發(fā)揮生肌作用。在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，原腸期是體軸建立和中內(nèi)胚層形成的重要時(shí)期。原腸胚形成過(guò)程中胚層的形態(tài)發(fā)生涉及一個(gè)復(fù)雜的機(jī)制，該機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞群的增殖、運(yùn)動(dòng)和模式化，以及遺傳和信號(hào)活動(dòng)中開(kāi)關(guān)的編排，可能驅(qū)動(dòng)胚胎的譜系規(guī)范和組織建模。在原腸胚形成過(guò)程中，與多能性調(diào)控、生殖層形成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)和離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因高度富集，并伴隨著組織特異性基因和形態(tài)發(fā)生驅(qū)動(dòng)因子的激活而向器官發(fā)生發(fā)展。重要的是，中晚期原腸胚轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)生了轉(zhuǎn)錄組的重大改變，表現(xiàn)為多能性相關(guān)基因的下調(diào)，TGFβ/BMP信號(hào)通路相關(guān)基因的高表達(dá)。本研究在卵形鯧鲹原腸中期到末期的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)MRF家族4個(gè)基因1、2、5與6轉(zhuǎn)錄表達(dá)的迅速升高。這意味著1、2、5與6基因從原腸末期開(kāi)始發(fā)揮重要的作用，這與骨骼肌在原腸期開(kāi)始形成在時(shí)間上相吻合。然而，對(duì)鱖()胚胎中MRF家族基因的研究發(fā)現(xiàn)，5、和在神經(jīng)胚期表達(dá)量急劇增加，這可能意味著MRF基因在不同魚(yú)類(lèi)不同發(fā)育階段的功能與表達(dá)存在差異，不同魚(yú)類(lèi)MRF家族基因的具體功能有待進(jìn)一步研究。