江轉轉，許 遠，宋亞玲

遺傳學的研究內容主要有三大部分：遺傳、變異、進化.遺傳是變異的基礎，變異是遺傳的發(fā)展，遺傳與變異共同推動著物種的進化.遺傳指的是親代與子代之間的相似，而變異指的是親代與子代之間的差異[1-3］.導致生物體發(fā)生性狀變異的原因有多種，如基因突變、基因重組、染色體結構變異、染色體數(shù)目變異，等等.其中基因重組是基于兩個DNA 片段之間的交叉互換而帶來的性狀重新組合.在遺傳學中，通過計算兩個基因間發(fā)生重組的概率來估計兩個基因間的距離，稱為遺傳分析或者遺傳作圖.在高等動植物中，可通過“兩點測驗”即一次雜交和一次測交確定兩個基因間的距離或“三點測驗”即一次雜交和一次測交確定三個基因間的距離來進行遺傳分析[4］.與高等動植物不同，微生物結構較為簡單，多數(shù)進行無性生殖，其基因重組及遺傳分析方式也較為特殊，無典型的雜交與測交，學生在學習時會存在很多的誤區(qū)，并且會將高等動植物遺傳分析的方法簡單套用在微生物遺傳分析上.為了明確不同微生物基因重組的實質，分析不同微生物基因重組的特點，改良各自遺傳分析的方法，本文以三種典型的微生物（粗糙脈孢霉、噬菌體、枯草桿菌）為例，以基因重組形式為主線，探討并剖析不同類型微生物遺傳分析方式及其基因重組的本質，幫助生物學專業(yè)學生在遺傳分析中厘清差異，弄清實質，舉一反三.

1 粗糙脈孢霉的基因重組及遺傳分析

粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）是一種比較常見的真菌，其體積小，易繁殖，同時可進行有性生殖與無性生殖，常作為遺傳學研究材料[4-5］.一般情況下，粗糙脈孢霉在進行有性生殖時會發(fā)生基因重組.粗糙脈孢霉的有性生殖發(fā)生在兩種不同類型的單倍體菌絲體之間（定義為“+”和“-”）.單倍體菌絲體產生的分生孢子染色體數(shù)為7，兩種不同交配型的分生孢子發(fā)生核融合，形成染色體數(shù)為14 的合子，合子經減數(shù)分裂與有絲分裂后形成8 個子囊孢子.因子囊太過狹窄，子囊孢子只能按照既定的順序排列在子囊中，稱為順序四分子（圖1）.

圖1 粗糙脈孢霉的有性生殖過程示意圖

粗糙脈孢霉的基因重組常發(fā)生在有性生殖的減數(shù)分裂時期，這與高等動植物一致.遺傳上可通過子囊孢子的排列順序來判斷同源染色體間是否發(fā)生基因重組，稱為四分子分析.若來自同一染色體的兩條姐妹染色單體呈相鄰排列，則認為沒有發(fā)生重組或發(fā)生了偶數(shù)次的重組，若來自同一染色體的兩條姐妹染色單體呈交叉排列，則認為發(fā)生了奇數(shù)次的重組（圖2）.多數(shù)遺傳學教材用如下公式來估算粗糙脈孢霉基因的重組率：

圖2 粗糙脈孢霉基因重組示意圖

然而，多次的教學反饋結果顯示，大部分學生無法理解計算公式中乘以二分之一的原因，部分學生甚至認為減數(shù)分裂后的有絲分裂擴大了重組率，因而要乘以二分之一.為了更正學生的誤區(qū)，筆者將上述公式做了如下變形，便于學生理解.

從圖2 可以看出，單交換可產生重組型子囊孢子，在交換型子囊里有一半是重組型子囊孢子，因此一個交換型子囊中有4 個重組型子囊孢子，4 個非重組型子囊孢子.而不論是交換型子囊還是非交換型子囊，均包含8 個子囊孢子.因此教材公式中的二分之一來源于分子與分母中數(shù)字的比值.

2 噬菌體的基因重組與遺傳分析

噬菌體是一類以細菌為寄主的病毒，其結構較為簡單，僅包含環(huán)狀DNA 遺傳物質及蛋白質外殼[6-7］.噬菌體的遺傳基因重組發(fā)生在侵染細菌階段.如圖3 所示，兩類不同的噬菌體h-r+與h+r-（h，host range mutant，宿主范圍突變型；r，rapid lysis，速溶性）侵染同一宿主，將自身的遺傳物質DNA 注入宿主細胞，并降解宿主DNA.在宿主細胞內，同源區(qū)段發(fā)生交叉重組，此過程類似于真核生物中的非姐妹染色單體交叉互換.同源區(qū)段的基因重組完成后會產生兩種數(shù)量相當?shù)闹亟M型（h-r-與h+r+），因此轉化后會出現(xiàn)四種不同類型的噬菌斑（h-r+、h+r-、h-r-與h+r+），因此計算交換值時只需將重組型噬菌斑數(shù)（h-r-與h+r+）除以總的噬菌斑數(shù)即可，公式如下：

圖3 噬菌體基因重組示意圖

在某些情況下，兩種重組型噬菌斑只有一種能夠被檢出，在計算交換值時，將檢出的重組型噬菌斑數(shù)量加倍后再除以總的噬菌斑數(shù)以估算交換值.

3 枯草桿菌的基因重組與遺傳分析

與粗糙脈孢霉及噬菌體不同，細菌的基因重組發(fā)生在線性DNA 片段與環(huán)形DNA 之間，現(xiàn)以黎德伯格的枯草桿菌（Bacillus subtilis）轉化實驗說明細菌基因重組的過程及遺傳分析方法.枯草桿菌可以通過其細胞膜攝取環(huán)境中的游離DNA 片段，稱為供體DNA，枯草桿菌自身的環(huán)狀DNA 則稱為受體DNA.供體DNA的基因型為色氨酸、組氨酸、絡氨酸野生型（trp2+his2+tyr1+，+++），受體DNA 為色氨酸、組氨酸、絡氨酸營養(yǎng)缺陷型（trp2-his2-tyr1-，---）.供體DNA 在DNA 結合蛋白的協(xié)助下附著在受體細菌表面的受體位點上，核酸外切酶降解供體雙鏈DNA 中的一條，另一條供體單鏈DNA進入受體細菌內.供體單鏈DNA 與受體雙鏈環(huán)狀DNA 在同源區(qū)段聯(lián)會，重組并置換受體雙鏈DNA 中的一條，形成供體-受體雜合DNA，而被置換的單鏈DNA 游離于細菌細胞中，不久會被降解.雜合DNA 復制后形成一個重組細胞和受體細胞（圖4）.與粗糙脈孢霉及噬菌體不同，在細菌中僅偶數(shù)次交換有效，而奇數(shù)次交換無效.原因在于線性供體DNA 與環(huán)狀受體DNA 若發(fā)生奇數(shù)次交換，則會導致環(huán)狀受體DNA 開環(huán)，而開環(huán)DNA 在細菌細胞中易被降解.

圖4 枯草桿菌基因重組流程示意圖

黎德伯格的枯草桿菌轉化實驗是以trp2+his2+tyr1+為供體，trp2-his2-tyr1-為受體，用補充有不同營養(yǎng)物質的培養(yǎng)基進行重組細菌的遺傳篩選，實驗結果如表1 所示，共篩選出7種不同基因型的重組子，這七種重組子都來源于偶數(shù)次的交換，而trp2-his2-tyr1-在選擇培養(yǎng)基上無法檢出，即使在完全營養(yǎng)型培養(yǎng)基上檢出也無法篩選出參與基因重組的數(shù)量，故在表中沒有列出.從實驗結果可以發(fā)現(xiàn)，等位基因型轉化子數(shù)量上有巨大的差異，如-++//+--，存在有1 000 以上的數(shù)量差，如此巨大的數(shù)量差反映出在細菌的轉化重組中，互為等位基因型的轉化子不是在同一次轉化中產生，這與細菌的轉化過程一致即相反的重組子不存在.基于細菌轉化重組的特殊性，筆者設計了如下的遺傳分析方法：首先根據親本基因型或重組基因型的數(shù)量推算出其等位基因型的數(shù)量，再依據數(shù)量的差異推算出不同的交換類型，并定義為交換型I、II、III.而后，可參照“三點測驗”的計算方法來計算基因間的距離.如trp2與his2基因之間的距離為交換型I的比例加上交換型III的比例，為33厘摩，而his2與tyr1基因之間的距離為交換型II的比例加上交換型III的比例，為12厘摩（表2）.此種計算方式與教材中的計算結果相當，而且更容易理解，能達到前后貫通的效果.

表1trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-（受體）的轉化子類型

表2trp2+his2+tyr1+（供體）×trp2-his2-tyr1-（受體）的重組率計算

4討論

遺傳學是研究基因間世代傳遞的規(guī)律，而微生物具有世代周期短、后代群體數(shù)量多的特點而備受遺傳學家青睞[8］.粗糙脈孢霉、噬菌體以及枯草桿菌是其中最為典型的代表，各自的遺傳分析方式既有相似也有差異.相似之處有以下兩點：第一，均是統(tǒng)計單倍體的表型.如在粗糙脈孢霉的遺傳分析中，統(tǒng)計的是不同表型的子囊孢子的數(shù)量而不是子囊的數(shù)量；在噬菌體中統(tǒng)計的是轉染后不同表型的子代噬菌體的數(shù)量；在枯草桿菌中統(tǒng)計的是不同類型轉化子的數(shù)量.而不論是子囊孢子或是子代噬菌體亦或是轉化子本質上均是單倍體，即只擁有某物種的一套遺傳物質.第二，有效重組均能在子代中顯現(xiàn).在單倍體中，所有基因的表型不會被掩蓋，原因在于單倍體中的所有基因均無對應的等位基因，無論基因的顯隱性在子代中均能得到反映[9］，基于此，只要發(fā)生有效的基因重組，那么在子代中均能得到顯現(xiàn).差異之處在于以下兩點：第一，發(fā)生重組的DNA形式不同.在粗糙脈孢菌中，基因重組發(fā)生在兩條線性DNA之間，若估算某一基因在基因組上的定位時可以借助著絲粒，把著絲點當作一個固定的位點，得到的重組率即為該基因與著絲粒之間的距離.并且，在此背景下，只有奇數(shù)次的交換有效而偶數(shù)次的交換無效，因為偶數(shù)次的交換不會產生有重組表型的子囊.在噬菌體中，重組發(fā)生在兩個環(huán)狀DNA之間.兩個環(huán)狀DNA之間若發(fā)生奇數(shù)次交換，則會發(fā)生融合，形成一個大的環(huán)狀DNA；若發(fā)生偶數(shù)次交換則產生兩個重組型的子代噬菌體.在枯草桿菌中，基因重組發(fā)生在單鏈線性供體DNA與雙鏈環(huán)狀DNA之間.在此背景下，只有偶數(shù)次的交換有效而奇數(shù)次的交換無效，因為奇數(shù)次的交換導致環(huán)狀DNA開環(huán)，開環(huán)的雙鏈DNA在細菌細胞中易被降解，無法傳遞至下一代.第二，遺傳分析方式不同.在粗糙脈孢霉中，因每一子囊中只有一半的孢子發(fā)生重組，因此在以子囊數(shù)為統(tǒng)計對象進行遺傳分析時，得到的重組率需除以二分之一，否則會使重組率偏大.噬菌體基因重組率的遺傳分析與高等植物中的三點測驗方式一致，即通過不同基因型的數(shù)量判斷交換類型，計算出每種交換類型的數(shù)量來標定基因間的順序和距離.而枯草桿菌的遺傳分析方式更為特殊，需根據某一基因型子代的數(shù)量推斷出其等位基因型子代的數(shù)量再參照三點測驗的方式進行基因重組率的計算.

綜上，不同的微生物因其物種特異性或遺傳方式特異性導致了遺傳分析方法有所差異，但需要明確的是，任何物種發(fā)生基因重組的實質是相同的，即同源的基因片段發(fā)生交換，而重組值反映的是同源片段間交換的概率[10］.本文將三種典型微生物（粗糙脈孢菌、噬菌體、枯草桿菌）基因重組過程及遺傳分析方式進行了細致地分析，且變形了粗糙脈孢菌遺傳分析計算公式，開發(fā)了枯草桿菌另一遺傳分析方式，比較了三種不同微生物遺傳分析的異同及其本質，幫助生物學專業(yè)學生辨析差異，靈活運用，融會貫通.