韓曉然

[摘 要] 冬蟲夏草是我國(guó)傳統(tǒng)中藥中的一種瀕危物種。關(guān)于冬蟲夏草及其無(wú)性型中國(guó)被毛孢的代謝已有很多研究報(bào)道，然而對(duì)于蝙蝠蛾幼蟲人工接種中國(guó)被毛孢后的代謝變化卻鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析可準(zhǔn)確判定人工培養(yǎng)物與天然冬蟲夏草的成分差異，從而找出與天然冬蟲夏草成分一致的培養(yǎng)物或僵蟲，同時(shí)避免有害雜菌感染的樣品用于替代天然冬蟲夏草，從而擴(kuò)大蟲草藥材的來(lái)源或找到更多、更安全的替代品，創(chuàng)造較大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)有利于保護(hù)野生蟲草資源和生態(tài)環(huán)境。

[關(guān)鍵詞] 冬蟲夏草;中國(guó)被毛孢;子囊孢子;代謝組學(xué);質(zhì)譜全解析

[中圖分類號(hào)] S567.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)]1674-7909（2020）06--2

1 材料和方法

1.1 材料

3齡蟲草蝙蝠蛾幼蟲，采自四川省德陽(yáng)縣蟲草基地，室內(nèi)短期人工飼養(yǎng)。

采自青海玉樹的天然冬蟲夏草經(jīng)人工誘導(dǎo)得到具有侵染能力的冬蟲夏草子囊孢子。

1.2 方法

1.2.1 接種培養(yǎng)

本研究以子囊孢子懸液為接種體，每個(gè)處理20只蝙蝠蛾幼蟲?？紤]到蝙蝠蛾幼蟲幾天就蛻皮一次，而蛻皮可能對(duì)侵染不利，故本試驗(yàn)選擇在進(jìn)行浸蘸接種之后進(jìn)一步采取穿刺接種法并同時(shí)將菌液混入幼蟲食物中，從而增加侵染成功率。

1.2.2 接種后處理

接種后將幼蟲放入事先編號(hào)的已滅菌的培養(yǎng)皿中，僅飼喂少量珠芽蓼，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于16 ℃、避光條件下培養(yǎng)。2 d后繼續(xù)給予珠芽蓼并注意補(bǔ)充無(wú)菌水以保濕培養(yǎng)，5 d后轉(zhuǎn)入土壤中繼續(xù)飼養(yǎng)。每隔4 d檢查統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡情況并加入少量珠芽蓼。珠芽蓼均要求進(jìn)行紫外線照射滅菌消毒。

將侵染所得的死亡僵蟲在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察后，置于凍干機(jī)中冷凍干燥后充入氬氣保護(hù)，并放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 代謝組分析

1.2.3.1 樣品的制備。將侵染所得的僵蟲、野外采集的野生僵蟲、天然冬蟲夏草以及人工培養(yǎng)的中國(guó)被毛孢菌絲體同時(shí)進(jìn)行冷凍干燥，之后分別將其置于研缽中磨碎備用;在進(jìn)行代謝組分析之前準(zhǔn)確稱取磨碎后的樣品各15 mg，加入1 mL甲醇提取液和Fmoc-glycine

（1 mg/mL）30 μL作為內(nèi)標(biāo)，渦旋30 s，25 ℃超聲提取

1 h后于4 ℃冰箱中靜置12 h。將提取物在1萬(wàn)r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液作為L(zhǎng)C-TOF/MS待測(cè)樣品。每組樣品各做6組生物學(xué)重復(fù)，并以甲醇溶液作為空白組進(jìn)行對(duì)照。

1.2.3.2 LC-TOF/MS條件。一是HPLC條件。色譜柱Agilent poroshell 120 EC-C18，2.7 μm，30 mm×100 mm，

進(jìn)樣體積3 μl，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min。就流動(dòng)相而言，A相是含0.1%甲酸的水溶液，B相是含0.1%甲酸的乙腈溶液。

二是質(zhì)譜條件。氮?dú)庾鳛楦稍餁怏w，氮?dú)鉁囟葹?50 ℃，流速為12 L/min，霧化氣壓35 psi;毛細(xì)管電壓，陽(yáng)離子4 000 V，陰離子3 500 V;碎裂電壓，陽(yáng)離子215 V，

陰離子170 V，錐孔電壓60 V;質(zhì)量采集范圍，陽(yáng)離子50～1 000 Da，陰離子50～1 100 Da。

1.2.3.3 代謝組數(shù)據(jù)分析。LC-MS采集的原始數(shù)據(jù)用MassHunter Software（Agilent Technologies，USA）的MFE運(yùn)算進(jìn)行自動(dòng)峰檢測(cè)和色譜去卷積，去除信噪比<

5的峰，提取出陰離子和陽(yáng)離子的絕對(duì)峰高≥5 000的峰，并將每個(gè)樣品的三維數(shù)據(jù)（出峰時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量和強(qiáng)度）導(dǎo)出保存。之后將導(dǎo)出的表格文件上傳至MetaboAnalyst[1]進(jìn)行峰對(duì)齊和濾噪處理，處理?xiàng)l件為質(zhì)量偏差0.01 Da、時(shí)間偏差0.5 min，以陽(yáng)離子（m/z）179.085 81、陰離子（m/z）364.079 66 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto Scaling處理。

1.2.3.4 代謝物識(shí)別。①通過(guò)數(shù)據(jù)處理分析得到的化合物，根據(jù)其質(zhì)譜特征、精確質(zhì)荷比和出峰時(shí)間等，利用MassHunter Qualitative Analysis Software初步確認(rèn)其分子式;②在本實(shí)驗(yàn)室積累的蟲生真菌天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB、METLIN上進(jìn)行搜索匹配，以確定化合物的名稱;③根據(jù)代謝物的洗脫順序（極性）和結(jié)構(gòu)性質(zhì)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;④將代謝物的UV譜圖與已知物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照，以確定需要查找的差異化合物;⑤對(duì)于一些存在爭(zhēng)議的代謝物質(zhì)，盡可能使用標(biāo)準(zhǔn)品或者查閱相關(guān)昆蟲病原真菌的代謝物報(bào)道進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工侵染所得僵蟲與天然冬蟲夏草HPLC-TOF-MS全成分分析

2.1.1 HPLC-TOF-MS圖譜比較。用HPLC-TOF-MS分別對(duì)通過(guò)子囊孢子懸液侵染所得僵蟲與天然冬蟲夏草的甲醇超聲提取液中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析比較。圖1是抽取的子囊孢子懸液侵染所得僵蟲的液質(zhì)聯(lián)用圖。從圖1可以看到，有些僵蟲HPLC-TOF-MS圖譜與野生冬蟲夏草幾乎完全一致，有些有明顯差異。

2.1.2 人工侵染所得僵蟲與天然冬蟲夏草的化學(xué)成分鑒定。通過(guò)HPLC-TOF-MS檢測(cè)得到僵蟲與天然冬蟲夏草中各化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，并結(jié)合提取離子流圖及與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比以及空白對(duì)照去除雜質(zhì)，最終進(jìn)行了化學(xué)成分的確認(rèn)，根據(jù)質(zhì)譜裂解特征鑒定的主要差異成分如下。

2.1.2.1 酵母氨酸。酵母氨酸t(yī)R為1.682 min的峰在ESI-模式下得到m/z為275.125 18的離子峰。綠僵菌中存在酵母氨酸，其分子質(zhì)量為276.132 14。中國(guó)被毛孢中沒有酵母氨酸的報(bào)道，而該僵蟲（1-3）體內(nèi)是否存在綠僵菌感染還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.1.2.2 粉擬青霉素。粉擬青霉素tR為31.919 min的峰在ESI-模式下得到m/z為372.218 66的離子峰。粉棒束孢中存在粉擬青霉素，其分子質(zhì)量為373.225 31。中國(guó)被毛孢中沒有粉擬青霉素的報(bào)道，而該僵蟲（1-4）體內(nèi)是否存在粉棒束孢侵染還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

在由子囊孢子懸液侵染所得的這組僵蟲里，僵蟲1-1和1-2與天然冬蟲夏草相比差異不大，每個(gè)時(shí)間段都基本可以找到與天然冬蟲夏草相對(duì)應(yīng)的代謝產(chǎn)物。然而，僵蟲1-3和1-4與天然冬蟲夏草相比差異較為明顯，可以看出部分代謝物只在僵蟲中出現(xiàn)，如酵母氨酸、Cytochalasin C、粉擬青霉素、（R）-3-Hydroxybutanoyloxy-butanoate。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)屬于某些與蟲草相關(guān)的蟲生真菌會(huì)產(chǎn)生的典型次級(jí)代謝產(chǎn)物，如粉棒束孢、綠僵菌等[2]。而1-3和1-4僵蟲是否包含粉棒束孢、綠僵菌這兩種真菌的混合侵染還需要進(jìn)行進(jìn)一步分析?？傊?，這些僵蟲不能作為天然冬蟲夏草的替代品。

3 結(jié)論

通過(guò)HPLC-TOF-MS全成分分析，可更直觀和準(zhǔn)確地比較差異，因此全圖譜比較分析可作為研究冬蟲夏草人工替代品的質(zhì)量控制、方法。從分析結(jié)果來(lái)看，本研究中雖然發(fā)現(xiàn)子囊孢子懸液侵染蝙蝠蛾幼蟲的成功率較高，但仍有明顯雜菌污染，在大規(guī)模進(jìn)行人工培養(yǎng)冬蟲夏草及其替代品培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)于如何避免雜菌污染來(lái)確保蟲草及其產(chǎn)品的真實(shí)性和高質(zhì)量，仍需要進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Jianguo X，Nick P，Nelson Y，et al. MetaboAnalyst： a web server for metabolomics data analysis and interpretation[J].Nucleic Acids Research，2009（37）：652-660.

[2]胡豐林，李增智.蟲草及相關(guān)真菌的次生代謝產(chǎn)物及其活性[J].菌物學(xué)報(bào)，2007（4）：607-632.