汪 河，王 莉*，申慧彥，李衛(wèi)華

（1.安徽建筑大學(xué) 環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2.環(huán)境污染控制與廢棄物資源化利用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601）

水質(zhì)衛(wèi)生檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，國(guó)內(nèi)外主要采用培養(yǎng)計(jì)數(shù)法[1]。這種方法雖具有易于標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果可比性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)也顯而易見(jiàn)——耗時(shí)長(zhǎng)（十幾小時(shí)到幾天不等），不能同時(shí)檢測(cè)多種項(xiàng)目，且檢測(cè)出的微生物數(shù)量由于培養(yǎng)手段的限制遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際數(shù)量[2-3]。鑒于此，一系列快速檢測(cè)方法如高光譜技術(shù)[4]、ATP 生物發(fā)光技術(shù)[5]、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法[6]和MTT 法[7]等不斷開(kāi)發(fā)出來(lái)。而分子生物學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)的熒光定量PCR 法[8]、原位雜交法[9]、熒光原位雜交法[10]等方法，則不僅實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)多種微生物指標(biāo)的設(shè)想，而且大大突破了環(huán)境微生物數(shù)量的檢測(cè)限度。

熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）是20 世紀(jì)80 年代初期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)[9]。其原理是把非放射性的熒光信號(hào)基團(tuán)標(biāo)記在特異性堿基序列的核酸探針上，再用帶有熒光標(biāo)記的探針與固定在玻片或?yàn)V膜上的細(xì)胞中特定的核苷酸序列進(jìn)行雜交，然后在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和攝像。目前，F(xiàn)ISH 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于淡水、海洋、土壤和活性污泥的微生物數(shù)分布、豐度以及整個(gè)微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、多樣性的觀察[11-14]。然而，在水質(zhì)衛(wèi)生檢測(cè)方面卻鮮少見(jiàn)報(bào)道。限制FISH 技術(shù)應(yīng)用的原因，很可能是因?yàn)樵摷夹g(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，雜質(zhì)干擾、酶解條件不適、雜交條件不適、清洗脫落、熒光淬滅等都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性[15-16]。本研究以水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)為主要觀察指標(biāo)，對(duì)FISH 技術(shù)的樣品固定和雜交環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，旨在為FISH 技術(shù)日后在水質(zhì)衛(wèi)生檢測(cè)的成熟應(yīng)用奠定一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：凈化工作臺(tái)（蘇州凈化SW-CJ-2D）；恒溫干燥箱（上海陽(yáng)光202-5SA）；恒溫生化培養(yǎng)箱。

蛋白酶K 緩沖液（50 mL）：1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）0.5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，5 mol/L NaCL 1 mL，10% SDS2.5 mL，20 mg/mL 蛋 白 酶K25 μL，44.98 mL ddH2O。

雜 交 緩 沖 液（2 mL）：5 mol/L NaCL360 μL，1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）40 μL，10% SDS 2 μL，甲酰胺800 μL，798 μL d H2O。

洗脫液（50 mL）：5 mol/L NaCL 560 μL，1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）1 mL，0.5 mol/L EDTA 500 μL，10% SDS 50 μL，47.89 mL d H2O。

1.2 樣品的采集與固定

樣品采集于安徽建筑大學(xué)校園內(nèi)湖水。取水樣1 000 mL 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，5 mL 0.2 mol/L PBS（pH 7.2，滅菌）下清洗細(xì)菌。取0.5 mL 清洗水樣加入0.5 mL 的冷凍乙醇固定，搖勻至-20 ℃保存。

1.3 FISH 過(guò)程及優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中使用的探針為針對(duì)所有真細(xì)菌的EUB338-mix（5’-GCWGCCWCCCGTAGGWGT-3’）[17]，探針在5’末端用氨甲香豆素乙酸（AMAC）染料標(biāo)記。FISH 基本操作按Nielsen[18]等人的方法：將10 μL 固定過(guò)的水樣置于預(yù)先用0.1 mg/mL 多聚賴氨酸包埋的載玻片上，樣品均勻攤開(kāi)后干燥制片；蛋白酶K 緩沖液處理，滅菌水清洗；載玻片依次在50%、80%和100%（V/V%）的乙醇溶液中各脫水3 min，風(fēng)干；雜交緩沖液和EUB338-mix 探針混合后加至載玻片覆蓋樣品區(qū)域，載玻片放入濕盒置于恒溫生化培養(yǎng)箱在46 ℃雜交；48 ℃洗脫液中浸洗20 min；滅菌水清洗，風(fēng)干備檢。

在以下幾個(gè)方面對(duì)FISH 過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化：自然干燥5 h 和46 ℃烘烤制片（2 h、5 h）；蛋白酶K 消化時(shí)間（2 min、5 min、10 min）；探針終濃度（2.5 ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL）；雜 交 時(shí) 間（2 h、5 h、10 h）。

1.4 鏡檢和計(jì)數(shù)

樣品通過(guò)熒光顯微鏡觀察，AMAC 標(biāo)記的FISH 信號(hào)通過(guò)紫外激發(fā)模塊觀察。所有數(shù)碼照片都在40×的物鏡下拍攝。每個(gè)FISH 條件樣品準(zhǔn)備3張雜化載玻片，每張載玻片隨機(jī)拍攝20張照片。每張照片中發(fā)熒光的細(xì)胞數(shù)通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 中的手動(dòng)計(jì)數(shù)功能計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 制片方式對(duì)細(xì)菌數(shù)量的影響

制片方式對(duì)細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的影響實(shí)驗(yàn)，截止在雜交步驟前。由材料與方法1.3 可知，F(xiàn)ISH 過(guò)程的蛋白酶K 消化和雜交后洗滌環(huán)節(jié)都需要清洗，而清洗或多或少會(huì)引起粘附在載玻片上的細(xì)胞掉片。有效增加細(xì)胞粘附力的做法通常是用明膠、多聚賴氨酸等粘附劑預(yù)先包埋載玻片[11-14]。除此之外，有人發(fā)現(xiàn)將粘附有樣品的載玻片37-60 ℃適當(dāng)烘烤也能一定程度地減少細(xì)胞掉片[12-13，19]。本實(shí)驗(yàn)觀察了自然干燥制片和46 ℃2 h、5 h）烘烤制片對(duì)載玻片細(xì)胞粘附力的影響。圖1 可見(jiàn)，和自然干燥組（a）相比，46 ℃烘烤對(duì)增加載玻片細(xì)胞粘力有一定的促進(jìn)作用，（b）和（c）細(xì)胞數(shù)量明顯多于（a）。但烘烤時(shí)間延長(zhǎng)至5 h 并不能明顯減少洗滌過(guò)程中的細(xì)胞流失，（b）和（c）細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異。因此下面實(shí)驗(yàn)制片采用46 ℃ 2 h 烤片。

圖1 不同制片方式下的細(xì)菌數(shù)量圖片

2.2 蛋白酶K 消化時(shí)間對(duì)雜交結(jié)果的影響

蛋白酶K 消化在FISH 中具有消化包圍靶DNA 蛋白質(zhì)的作用，以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì)，提高雜交信號(hào)。但蛋白酶K 的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí)，都會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)有一定的破壞，影響細(xì)胞的完整性或?qū)е录?xì)胞脫落，從而影響雜交結(jié)果。根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)[13，16，20]，終濃度10 μg/mL 溫度37 ℃分別是FISH 檢測(cè)中消化細(xì)菌靶DNA 蛋白質(zhì)較佳的濃度和溫度條件，而消化時(shí)間則需要根據(jù)樣品去實(shí)際摸索。

由圖2 和表1 可知，水中細(xì)菌總數(shù)的FISH 檢測(cè)應(yīng)設(shè)蛋白酶K 消化環(huán)節(jié)，和未用蛋白酶K 消化組（26±0.83）比，其他各組的熒光細(xì)胞數(shù)（＞ 70）均明顯增加（和0 min 組相比，2 min 和5 min 組均P＜0.001，10 min 組P＜0.05）。蛋白酶K 消化時(shí)間控制在5 min 內(nèi)較合適，繼續(xù)消化會(huì)大大減少熒光信號(hào)。2 min（b）和5 min（c）消化組熒光信號(hào)數(shù)（128±5.66 和135±3.27）沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），而當(dāng)溫度延長(zhǎng)至10 min（d）時(shí)，熒光信號(hào)數(shù)量大大減少（72±1.62）（和5 min 組相比，P＜0.01）。下面的實(shí)驗(yàn)蛋白酶K 消化時(shí)間統(tǒng)一采用2 min。

表1 不同蛋白酶K 消化時(shí)間下的熒光細(xì)胞數(shù)量

2.3 探針終濃度對(duì)雜交結(jié)果的影響

FISH 檢測(cè)中，一般來(lái)說(shuō)，探針濃度越大，雜交率會(huì)越高。但探針濃度過(guò)高會(huì)造成背景染色過(guò)高，探針濃度過(guò)低又會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)的不足。根據(jù)國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究人員[12-14，18，21]的經(jīng)驗(yàn)，當(dāng)探針終濃度為5 ng/μL 左右時(shí)，F(xiàn)ISH 檢測(cè)可以得到較佳的信噪比，我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了相關(guān)研究的結(jié)果，圖3 顯示，隨探針濃度增加，雜交信號(hào)越高。表1 可見(jiàn)，當(dāng)探針濃度從2.5 ng/μL 增加至10 ng/μL 時(shí)，樣品的熒光細(xì)胞數(shù)量也從61 ± 2.12 增加至232 ± 11.02（和2.5 ng/μL 組 相 比，5 ng/μL 組P ＜ 0.01，10 ng/μL 組P ＜ 0.001）。但需要注意的是，10 ng/μL 下的雜交背景稍高，因此，下面的實(shí)驗(yàn)探針雜交終濃度采用5 ng/μL。

圖3 不同探針濃度下的細(xì)菌FISH 圖片

表2 不同探針濃度下的熒光細(xì)胞數(shù)量

2.4 雜交時(shí)間對(duì)雜交結(jié)果的影響

雜交時(shí)間對(duì)雜交也有較大的影響。時(shí)間過(guò)短會(huì)造成雜交不完全，而過(guò)長(zhǎng)則會(huì)增加非特異性雜交。據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)表明，雜交時(shí)間因探針及樣品的不同而不同，有的探針時(shí)間短至1-2 h[11，14，22]，有的探針需長(zhǎng)至6 h 甚至過(guò)夜[20，23]。一般認(rèn)為，寡核苷酸探針可在6 h 以內(nèi)和目標(biāo)細(xì)胞完成雜交[11，14，16，22]。圖4 和表1 表明，5 h 是本實(shí)驗(yàn)比較合適的雜交時(shí)間，此時(shí)，寡核苷酸探針EUB338-mix 能與細(xì)菌細(xì)胞充分地結(jié)合。和5 h 相比，2 h 顯然雜交尚未完成，熒光信號(hào)相對(duì)較低（5 h 250±13.83；2 h 158±8.51）（兩組相比，P＜0.01）。而當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至10 h，熒光信號(hào)并未明顯提高（10 h 273±16.69）（和5 h 組相比，P＞0.05）。

圖4 不同雜交時(shí)間下的總細(xì)菌FISH 圖片

表3 不同雜交時(shí)間下的熒光細(xì)胞數(shù)量

2.5 條件優(yōu)化后的FISH 定量結(jié)果比較

表4 顯示了優(yōu)化條件下（46 ℃ 2 h 制片，蛋白酶K 消化時(shí)間2 min，探針濃度5 ng/μL，46 ℃雜交5 h）的三次FISH 檢測(cè)結(jié)果。顯然，三次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的熒光細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），分別為267±10.19、253±5.62 和272±16.07?？梢?jiàn)，優(yōu)化后的FISH 技術(shù)檢測(cè)結(jié)果具有較高的穩(wěn)定性，提示將FISH 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于水的衛(wèi)生檢測(cè)是可行的。

表4 優(yōu)化條件下的FISH 實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果

3 結(jié)論

本研究主要針對(duì)FISH 在水質(zhì)衛(wèi)生檢測(cè)中結(jié)果穩(wěn)定性差的問(wèn)題，在細(xì)胞制片、蛋白酶K 消化時(shí)間、探針雜交濃度和雜交時(shí)間四個(gè)方面對(duì)FISH 技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到如下結(jié)果：

（1）細(xì)胞制片烘烤比自然干燥好，適度烘烤可一定程度減少FISH 過(guò)程因洗滌造成的細(xì)菌細(xì)胞流失，46 ℃ 2 h 烘烤的合適條件。

（2）水質(zhì)細(xì)菌總數(shù)的FISH 檢測(cè)應(yīng)設(shè)蛋白酶K消化環(huán)節(jié)，終濃度10 μg/mL 的蛋白酶K 37 ℃作用細(xì)菌細(xì)胞2 min，可得到較佳的信噪比。

（3）探針終濃度5 ng/μL，46 ℃ 5 h，可使寡核苷酸探針EUB338-mix 與細(xì)菌細(xì)胞充分地結(jié)合。

（4）條件優(yōu)化后的FISH 定量結(jié)果穩(wěn)定性較好，優(yōu)化條件下FISH 技術(shù)三次檢測(cè)的熒光細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異。本研究結(jié)果為FISH 法日后在水質(zhì)衛(wèi)生檢測(cè)的成熟應(yīng)用奠定了一定的技術(shù)基礎(chǔ)。