謝 琪 劉玉梅 韓風(fēng)慶 莊 木 李占省

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

根腫病是一種土傳病害，對(duì)世界范圍內(nèi)的十字花科作物危害嚴(yán)重，該病可由蕓薹根腫菌（）侵染植株根系引發(fā)，根腫菌在土壤中可存活數(shù)年，傳播方式呈現(xiàn)多樣化。近些年，我國(guó)青花菜（L.var.）栽培面積逐年增加（李占省 等，2021），根腫病也開(kāi)始在部分地區(qū)發(fā)生且呈擴(kuò)大趨勢(shì)，目前已在浙江、云南、湖北、河南、重慶等地發(fā)生。根腫病會(huì)造成青花菜商品性降低，甚至難以形成正?；ㄇ颍绊懏a(chǎn)量和質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)造成絕收。

十字花科根腫病的防治方法有物理防治（撒石灰、石灰氮等）和化學(xué)防治（氟啶胺）等，但最根本的方法是選育抗性品種（Webster &Dixon，1991；Wallenhammar et al.，2008）。目前，根腫菌在土壤中侵染十字花科作物的生活史已很清楚（楊曉琴，2015）。十字花科根腫病鑒定方法主要分為兩類，一是建立在病圃基礎(chǔ)上的鑒定技術(shù)，二是離體接種鑒定。兩種方法鑒定周期均較長(zhǎng)，管理風(fēng)險(xiǎn)大，耗費(fèi)大量的人力與物力，故探索和建立十字花科根腫病快速鑒定方法將極大地提高鑒定效率（Deora et al.，2012）。

根腫菌生理小種的鑒定方法主要有兩種：Williams 鑒定系統(tǒng)和歐洲根腫病ECD 鑒定系統(tǒng)（Williams，1966；Buczackl et al.，1975）。Williams 鑒定系統(tǒng)具有寄主少、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)際上被廣泛使用。然而，Williams 鑒定系統(tǒng)只能鑒別出13 個(gè)生理小種，且當(dāng)多個(gè)生理小種混雜時(shí)，采用Williams 鑒定系統(tǒng)并不能夠準(zhǔn)確地將優(yōu)勢(shì)小種鑒別出來(lái)，所以該方法存在一定的局限性（Feng et al.，2016；白宇鵬，2019）。ECD 鑒定系統(tǒng)具有較好的實(shí)用性，準(zhǔn)確度較高，且能夠更加細(xì)致地劃分生理小種，但ECD 鑒定系統(tǒng)寄主較多，存在難收集、工作量較大和操作程序較為復(fù)雜的問(wèn)題（丁云花 等，2013；朱翠娟，2016）。原玉香等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)同一地區(qū)的2 份菌株進(jìn)行鑒定時(shí)，采用Williams 鑒定系統(tǒng)和ECD 鑒定系統(tǒng)鑒定的結(jié)果不一致，表明兩種鑒定系統(tǒng)對(duì)同一地區(qū)生理小種的鑒定結(jié)果存在差異。近些年，水培接種法作為一種快速鑒定根腫病抗性的技術(shù)逐漸顯現(xiàn)其優(yōu)越性，具有操作簡(jiǎn)單、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)離體接種和染色觀察（杜艷 等，2016），可以從細(xì)胞學(xué)水平上快速鑒定十字花科作物根腫病抗性，應(yīng)用前景廣闊。

相比十字花科作物，根腫病不會(huì)對(duì)茄果類作物造成危害，探尋及利用該抗性機(jī)理選育抗根腫病的十字花科作物新品種具有極其重要的意義和科學(xué)價(jià)值。因此，揭示并闡明十字花科和茄果類作物在根腫菌侵染過(guò)程及其防御能力上的差異，將為創(chuàng)制十字花科抗根腫病種質(zhì)資源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019 年7—9 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行，種子均為商品種，青花菜品種為中青10 號(hào)和中青16 號(hào)，番茄（）品種為中雜302，辣椒（L.）品種為中椒115，均由本所自主育成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子預(yù)處理 2019 年7 月將青花菜、番茄和辣椒種子撒播在浸濕的濾紙上，將濾紙放入培養(yǎng)皿中催芽，6 d 后將幼苗移到15 mL 的離心管中，每管加入14 mL 蒸餾水，只放入1 株幼苗用泡沫篩固定，離心管用錫箔紙包裹進(jìn)行遮光處理，根腫菌侵染過(guò)程在水培溶液中進(jìn)行（圖1）。

圖1 青花菜、番茄與辣椒水培試驗(yàn)

1.2.2 根腫菌分子輔助鑒定 供試根腫菌菌株來(lái)自河南新野青花菜、大白菜腫塊，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所魏小春老師提供并已鑒定為生理小種4 號(hào)，將根腫病腫塊洗凈風(fēng)干后超低溫（-80 ℃）保存?zhèn)溆?。采用CTAB 法提取腫塊DNA（李占省，2012）。

根據(jù)已報(bào)道的根腫菌生理小種特異引物（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和鑒定（Zheng et al.，2018）。PCR 反應(yīng)體系：5.0 μL 的2×Plus Master Mix，2.0 μL 的ddHO，2.0 μL DNA，正反引物各0.5 μL，總體積10.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min，10 ℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，每孔點(diǎn)入5 μL PCR 產(chǎn)物，在150 V 恒壓下電泳25 min，后置于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察。

表1 根腫菌生理小種特異引物信息

1.2.3 根腫菌菌液制備 將-80 ℃冰箱中的根腫病腫塊在室溫下解凍，稱取10.0 g，用刀片將根腫病腫塊切成小片后放入研磨機(jī)，加入1.0 L 蒸餾水機(jī)械研碎成漿液，時(shí)間為3 min。將磨好的漿液用8 層尼龍網(wǎng)布過(guò)濾，以500 r·min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，最后，用血球計(jì)數(shù)板和光學(xué)顯微鏡將孢子濃度稀釋至4 × 10個(gè)·mL，4 ℃保存?zhèn)溆茫▓D2）。

圖2 根腫菌菌液制備流程

1.2.4 根腫菌侵染 移至離心管的中青16 號(hào)、中青10 號(hào)、中椒115 和中雜302 幼苗水培3 d 后，在離心管中加入2 mL 孢子濃度為4 × 10個(gè)·mL的根腫菌菌液，侵染處理過(guò)程參考張小麗（2014）的方法并進(jìn)行調(diào)整。將接種后的水培苗放入人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：16 h 光照，25 ℃；8 h黑暗，20 ℃；相對(duì)濕度75%。

1.2.5 鏡檢觀察 在接種后7、12、14 d，利用顯微鏡對(duì)供試對(duì)象根細(xì)胞進(jìn)行觀察，確定初級(jí)、次級(jí)侵染時(shí)期根腫菌侵染過(guò)程。首先，用蒸餾水清洗試驗(yàn)材料根上的附著孢子，然后將根切成1～2 cm 長(zhǎng)的小段，用FAA 固定24 h，同時(shí)用熒光桃紅染液染色15 min，染好的根部組織置于載玻片上用清水沖洗掉多余染液，最后進(jìn)行鏡檢觀察，分別統(tǒng)計(jì)侵染和未侵染的根毛數(shù)，計(jì)算根毛侵染率。每時(shí)間點(diǎn)選取3 個(gè)單株分別觀察和拍照。

根毛侵染率=（被侵染的根毛數(shù)/觀察的總根毛數(shù)）× 100%

2 結(jié)果與分析

2.1 生理小種的分子輔助鑒定

根據(jù)已報(bào)道的根腫菌生理小種特異引物對(duì)河南新野菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明，6 對(duì)特異引物Novel342-2、Novel407-2、PBRA_007750-2、PBRA_008439-1、PBRA_009348-1 和Actin1 均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖3）。通過(guò)Novel342-2、PBRA_009348-1 和Novel407-2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果可以確定4 號(hào)、7 號(hào)和9 號(hào)生理小種的存在情況，若特異引物Novel342-2 能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌4 號(hào)生理小種；若特異引物Novel342-2 或Novel407-2 不能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌7 號(hào)生理小種；若特異引物PBRA_009348-1 能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，且Novel342-2 或Novel407-2 不能擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物，則可以鑒定存在根腫菌9 號(hào)生理小種。本試驗(yàn)中，特異引 物Novel342-2、PBRA_009348-1和Novel407-2 均能擴(kuò)增出特異片段，故可以確定該菌株存在4 號(hào)生理小種，不存在7 號(hào)和9號(hào)生理小種。通過(guò)特異引物PBRA_007750-2、PBRA_009348-1 和PBRA_008439-1 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果可以判斷11 號(hào)生理小種的存在情況，若特異引物PBRA_009348-1 未擴(kuò)增出特異產(chǎn)物而PBRA_007750-2 或PBRA_008439-1 可以擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，則可以推斷存在根腫菌11 號(hào)生理小種，但本試驗(yàn)中，特異引物PBRA_009348-1 能擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，可推斷該供試菌株中不存在11 號(hào)生理小種。綜上所述，推斷該根腫菌只存在4 號(hào)生理小種（表2），這與河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所原玉香等（2017）的報(bào)道結(jié)果一致。

圖3 根腫菌生理小種PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

表2 根腫菌生理小種標(biāo)記鑒定條件及結(jié)果

2.2 青花菜、番茄和辣椒根腫菌侵染過(guò)程觀察比較

水培青花菜根腫菌侵染過(guò)程顯示，青花菜根部用熒光桃紅染液染色后，被根腫菌侵染的根毛呈紅色，未被侵染的根毛為無(wú)色。圖4-a 顯示，在接種后7 d，青花菜根毛細(xì)胞內(nèi)有大量分生孢子侵入，表明根腫菌已侵染根毛，此時(shí)中青16 號(hào)的根毛侵染率為46.62%（圖5）。在青花菜根腫菌侵染過(guò)程中，中青16 號(hào)比中青10 號(hào)生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，接種后，中青16 號(hào)能維持較長(zhǎng)一段時(shí)間的正常生長(zhǎng)，而中青10 號(hào)在接種后死亡速度較快，故未能進(jìn)行觀察。圖4-a Ⅳ中可以觀察到有部分孢子從根毛已進(jìn)入到根部皮層細(xì)胞內(nèi)，圖4-a Ⅵ表明根腫菌已明顯侵染根部皮層細(xì)胞，根部皮層細(xì)胞內(nèi)有大量的孢子囊形成。隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，接種后12 d 比7 d 時(shí)的根毛侵染率明顯提高25.38%。到接種后14 d 時(shí)，根毛侵染率上升減緩，比接種后12 d 時(shí)提高了11.40%，根毛侵染率達(dá)到83.40%。由此可見(jiàn)，在接種后7～14 d 根腫菌能夠快速侵染青花菜，且在不同基因型間存在侵染速率上的差異。本試驗(yàn)中，中青16 號(hào)相比中青10 號(hào)在接種后能夠延長(zhǎng)生存時(shí)間，滯緩根腫菌侵染速率，但在接種后14 d 時(shí)，中青16 號(hào)根部皮層細(xì)胞內(nèi)仍形成大量的孢子囊。

番茄品種中雜302 水培接種根腫菌侵染過(guò)程顯示（圖4-b），在接種后7 d 時(shí)根腫菌開(kāi)始侵染根毛，此時(shí)根毛侵染率較高，為32.80%（圖5），但比青花菜中青16 號(hào)的根毛侵染率低。接種后12 d 時(shí)仍有部分番茄根毛被根腫菌侵染，相比接種后7 d 的根毛侵染率提高不到10%，部分根腫菌孢子已進(jìn)入根部皮層細(xì)胞，但明顯低于中青16 號(hào)的侵染率。接種后14 d 時(shí)番茄根毛發(fā)生明顯扭曲，根部皮層細(xì)胞可明顯觀察到侵入的根腫菌分生孢子，此時(shí)根毛侵染率為48.21%。從根腫菌的侵染過(guò)程來(lái)看，番茄品種中雜302 與青花菜品種中青16 號(hào)的侵染途徑近似：根腫菌先侵染根毛區(qū)，再逐漸侵染根部皮層，但在接種后7～14 d 中雜302 的根毛侵染率明顯低于同時(shí)期的中青16 號(hào)；相比青花菜，番茄皮層細(xì)胞內(nèi)僅能形成少量的分生孢子，不能形成孢子囊。

圖4 根腫菌侵染中青16 號(hào)、中雜302 及中椒115 的根部染色觀察

從辣椒品種中椒115 水培接種根腫菌侵染結(jié)果可以看出（圖4-c），中椒115 根腫菌孢子進(jìn)入根毛量最少，接種后7 d 時(shí)根毛細(xì)胞極少被根腫菌孢子侵染，根毛侵染率只有10.56%（圖5）。接種后12 d 時(shí)根腫菌已侵染根部皮層細(xì)胞，但只有極少數(shù)分生孢子，沒(méi)有形成孢子囊，根毛侵染率較低，為12.6%。接種后14 d 時(shí)根毛侵染率只上升不到2%。相比中青16 號(hào)和中雜302，中椒115 根毛侵染率最低，程度最輕。

圖5 不同品種在不同時(shí)期的根毛侵染率

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，十字花科作物受根腫病影響和危害越來(lái)越大，備受國(guó)內(nèi)外關(guān)注。青花菜在國(guó)內(nèi)外廣泛種植，2019 年我國(guó)種植面積約8.67 萬(wàn)hm（李占省 等，2019）。目前，根腫病已嚴(yán)重危害青花菜主產(chǎn)區(qū)的栽培，如浙江臺(tái)州、云南通海、河南新野等地，危害面積逐年增加。

為了更好地挖掘和創(chuàng)制青花菜抗根腫病資源，本試驗(yàn)以抗根腫病的茄果類蔬菜作物番茄和辣椒為對(duì)照，以感病青花菜作為目標(biāo)研究對(duì)象，通過(guò)水培法觀察根腫菌侵染茄果類和十字花科類作物根部細(xì)胞的過(guò)程，來(lái)揭示對(duì)照組和感病組在根腫菌侵染過(guò)程中的差異變化，為十字花科選育抗根腫病資源提供一種新思路。本試驗(yàn)為了準(zhǔn)確鑒定根腫菌生理小種的種類，結(jié)合國(guó)內(nèi)外報(bào)道，特選用根腫菌生理小種特異分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，與原玉香等（2017）報(bào)道的河南新野菌株為4 號(hào)生理小種的研究結(jié)果一致，表明分子鑒定可作為一種輔助手段實(shí)現(xiàn)根腫菌生理小種的快速鑒定。

不同青花菜基因型間以及不同科屬作物間根腫菌的侵染過(guò)程均存在顯著差異，但相同的是番茄、辣椒與青花菜一樣，在水培條件下都能夠被根腫菌侵染，且其侵染過(guò)程與十字花科作物青花菜相似，都是從進(jìn)入根毛開(kāi)始，再侵染根部皮層細(xì)胞，形成分生孢子或孢子囊，但在根腫菌侵染率方面，三者存在明顯差異：青花菜上根腫菌的根毛侵染率明顯高于番茄和辣椒。從觀察結(jié)果來(lái)看，雖然后期中青16 號(hào)、中雜302 和中椒115 的根毛侵染率均有所增加，但番茄和辣椒明顯低于青花菜，與接種后12 d相比，接種后14 d時(shí)番茄根毛侵染率提高了6.41%，辣椒根毛侵染率提高了1.80%，而青花菜根毛侵染率提高了11.40%；從進(jìn)入根毛的根腫菌孢子數(shù)量來(lái)看，中青16 號(hào)也明顯多于中雜302 和中椒115。綜上所述，青花菜與番茄、辣椒在根腫菌侵染率方面存在明顯差異，青花菜根腫菌侵染速率和侵染率最高，其次是番茄，辣椒最低，且番茄、辣椒根部皮層細(xì)胞不能形成孢子囊。

本試驗(yàn)中，番茄和辣椒根際分泌物可能發(fā)揮了根腫菌防御作用，但在水中根際分泌物可能有別于土壤（Gossen et al.，2019），水中番茄和辣椒的根際分泌物會(huì)被稀釋，因此根腫菌能夠侵染根毛和皮層。土壤栽培環(huán)境下根腫病并不會(huì)對(duì)番茄和辣椒造成危害，從而驗(yàn)證了茄果類蔬菜根際分泌物的重要性，暗示了可以通過(guò)在土壤中增施茄果類蔬菜根際分泌物的方式來(lái)預(yù)防和降低十字花科蔬菜根腫病的危害，這將是一種更加綠色、環(huán)保和高效的方法（張婷玉 等，2014；韓旭 等，2015；楊丹丹 等，2018；Fu et al.，2019）。此外，高附加值的十字花科作物或許可以通過(guò)嫁接茄果類作物優(yōu)良砧木來(lái)預(yù)防根腫病的發(fā)生。本試驗(yàn)結(jié)果為以上兩種方法提供了一定的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，為選育十字花科高抗和免疫根腫病材料提供了新思路。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的十字花科蔬菜抗根腫病基因主要來(lái)自蕪菁、蘿卜和大白菜（Suwabe et al.，2003，2006；Zhang et al.，2015），其中蕪菁報(bào)道最多，發(fā)現(xiàn)了11 個(gè)主效基因或QTL（Piao et al.，2004），茄果類蔬菜尚未見(jiàn)抗根腫病基因的相關(guān)報(bào)道，其免疫機(jī)理有待深入研究與利用。