杜艷等

摘要：十字花科根腫病是一種世界性的重要病害，一直是國內(nèi)外研究的熱點。概述了該病病原菌的生活史、分子檢測、分子致病機理及根腫病防治等研究現(xiàn)狀，并對其研究趨勢進行了展望，以期為我國十字花科根腫病的防治提供參考。

關(guān)鍵詞：十字花科；根腫?。皇|薹根腫菌；致病機理；防治

中圖分類號： S432.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0122-05

收稿日期：2014-03-19

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）2058]；江蘇省自然科學基金青年基金（編號：BK20140748）。

作者簡介：杜艷（1984—），女，安徽阜陽人，博士，助理研究員，從事園藝作物病害及其生物防治研究。E-mail：dy411246508@126.com。

通信作者：劉郵洲，博士，副研究員，從事園藝作物病害生物防治研究。Tel：（025）84390228；E-mail：shitouren88888@163.com。十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的一種重要土傳病害。除了危害十字花科作物油菜、甘藍、白菜等外，還危害十字花科野生植物薺菜等。根腫病最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸（英國，1736），爾后在前蘇聯(lián)（1872）發(fā)現(xiàn)。目前幾乎每個栽培十字花科作物的國家和地區(qū)都有該病的發(fā)生，全球范圍內(nèi)所造成的作物產(chǎn)量損失占總產(chǎn)量的10%～15%[1]。近年來，根腫病在我國東北、山東青島、長江中上游以及西南等地迅速擴大，常年危害面積高達320萬～400萬hm2，占十字花科作物種植面積的1/3以上[2-3]。隨著十字花科作物種植面積的不斷擴大，根腫病給我國十字花科作物的安全生產(chǎn)帶來嚴重威脅。本文結(jié)合國內(nèi)外研究現(xiàn)狀對根腫病作了概述，以期為十字花科根腫病的防治提供參考。

1蕓薹根腫菌的生物學特性

1.1蕓薹根腫菌的分類地位

蕓薹根腫菌（P. brassicae）由俄國學者Woronin首次發(fā)現(xiàn)并命名[4]。對于蕓薹根腫菌的分類地位，一直備受爭議。Hawksworth等將其歸為真菌界黏菌門根腫菌綱[5]，而Alexopoulos和Mims將其劃分到真菌界鞭毛菌亞門根腫菌屬[6]。目前公認的觀點是將根腫菌歸到原生動物界根腫菌門根腫菌綱根腫菌屬[7]。

1.2根腫菌的形態(tài)特征

根腫病菌的休眠孢子囊在寄主根部薄壁組織細胞內(nèi)形成，球形或扁圓形、單胞、無色或略帶灰色，大小1.6～4.6 μm，常密集呈魚卵狀[2]。休眠孢子表面有刺狀突起，掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)不同寄主休眠孢子的形態(tài)和大小略有差異。例如：油菜根腫菌休眠孢子平均大小3.5 μm[8]；甘藍根腫菌休眠孢子平均大小2.5 μm[9]；小白菜根腫菌休眠孢子平均大小2.8 μm[10]。不同寄主游動孢子的形態(tài)和大小也略有不同，掃描電鏡下觀察游動孢子紡錘形或梨形，大小2.8～59 μm，同側(cè)著生不等長的雙鞭毛[11]。另外，黃云等在觀察油菜根腫菌游動孢子的形態(tài)及變化過程時，首次觀察到侵入結(jié)構(gòu)管腔[8]。

1.3根腫菌的生活史及病害發(fā)生規(guī)律

根腫病菌生活史包括3個階段：休眠孢子、根毛侵染和皮層侵染（圖1）[12]。休眠孢子黏附在種子或帶有病殘體的土壤及未腐熟的廄肥中越冬。在條件適宜時，休眠孢子萌發(fā)釋放一個橢圓形或者梨形雙鞭毛的游動孢子，稱為初級游動孢子。這些初級游動孢子到達寄主根毛，穿透根毛細胞壁，并在其內(nèi)部形成初生原質(zhì)團，初生原質(zhì)團分裂形成游動孢子囊，每個游動孢子囊含有4～16個次級游動孢子，該階段稱為初級侵染階段。隨后，次級游動孢子釋放到土壤中，繼而侵入根表皮，并在根表皮細胞內(nèi)定殖，形成大量的次級原質(zhì)團，次級原質(zhì)團經(jīng)減數(shù)分裂形成數(shù)百萬個休眠孢子，此時根部腫大形成根瘤，稱為次級侵染階段。當根腫組織分解后，這些休眠孢子又釋放到土壤中，從而完成整個侵染循環(huán)過程。當環(huán)境條件適宜時，休眠孢子萌發(fā)進行再侵染。在這一系列過程中，休眠孢子是如何聚集到根部，初級游動孢子能否直接侵入寄主根表皮細胞，次級游動孢子能否再分化形成初級原生質(zhì)團，為何存在初級侵染和次級侵染2個階段等問題仍然不清楚。

一般認為土壤酸堿度和溫濕度與根腫病的發(fā)生非常密切。根腫病發(fā)病的適宜土溫在18～25 ℃，土壤pH值在 5.8～6.5，土壤濕度在60%以上[13]。發(fā)病程度與當年的溫度、降雨和土壤pH值等因素有關(guān)，其中溫度對根腫病的發(fā)生至關(guān)重要。當溫度低于12 ℃或者高于25 ℃時，不利于根腫病的發(fā)生[14-15]。Buczacki等認為播種后第2周和第3周的溫度和光照水平對根腫病的發(fā)生影響最大[16]。Sharma研究發(fā)現(xiàn)不同溫度條件影響根腫菌侵染寄主，而且發(fā)病的嚴重程度與溫度有顯著的相關(guān)性[17-18]。

2根腫菌的生理小種鑒定

根腫菌的生理小種鑒定直接關(guān)系到根腫病抗病品種的有效選育，因此國際上一直非常重視根腫菌生理小種的劃分和鑒定。1931年，Honig最先發(fā)現(xiàn)不同來源的根腫菌引起的寄主反應(yīng)存在顯著差異，證實根腫菌存在小種分化[19]。1965年，Williams采用2個結(jié)球甘藍品種Jersey Queen和Badger Shipper以及2個蕪菁甘藍品種Laurentian和Wilhelmsburger對多個國家的根腫菌小種進行鑒定，正式提出Williams鑒別系統(tǒng)[20]。隨后，Buczacki等選用國際上不同研究小組的寄主材料于1975年建立了一套ECD（European clubroot differential set）鑒別系統(tǒng)[21]。該系統(tǒng)由B. rapa L. Sensu lato（2n=20）、B. napus L.（2n=38）和B. oleracea L.（2n=18）3組十字花科蕓薹屬寄主組成。自此，Williams和ECD這2套鑒別系統(tǒng)逐漸在歐洲、美國、加拿大、日本、中國等國家應(yīng)用和推廣。然而，這2套鑒別系統(tǒng)各有優(yōu)缺點。Williams鑒別系統(tǒng)具有鑒別寄主少、容易理解、操作方便等優(yōu)點，但是對個別小種無法明確鑒定，應(yīng)用時存在一定的局限性。ECD系統(tǒng)雖然對生理小種劃分相對準確，但是對鑒別寄主要求高，工作量大且命名復雜，不適于抗病品種的選育。而且，該系統(tǒng)多數(shù)寄主是歐洲油菜品種，在亞洲適用較為困難。此外，國際上還有somé[22]和Kuginuki[23]2套鑒別系統(tǒng)，由于其適用范圍窄，目前應(yīng)用較少[24]。因此，有必要完善和改進根腫菌生理小種鑒定系統(tǒng)，從而建立一套更加精確的、科學的、適合我國致病力分化特點的生理小種鑒定系統(tǒng)，以滿足我國對該病防控的需要。

3根腫菌的分子生物學研究進展

3.1根腫菌的分子檢測

分子生物技術(shù)的發(fā)展為植物病害診斷提供了重要的技術(shù)手段。1999年，Lto等首次將PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)應(yīng)用到根腫菌的檢測[25]。Manzanares等繪制了不同根腫病菌單孢分離菌群的RAPD圖譜，發(fā)現(xiàn)同屬某一特殊類型的病原菌（P1）有共同的分子標記-PL14（1200）[26]。Cao等設(shè)計1對特異性引物檢測出土壤中含量低于103個/g的休眠孢子以及被侵染3 d后根組織中的病原菌[27]。由于該引物快捷、簡便、特異性強，目前被廣泛應(yīng)用于根腫菌的檢測。

近年來，陸續(xù)發(fā)展的新技術(shù)（包括巢式PCR、Real-Time PCR技術(shù)等）也被用于根腫病菌的檢測和鑒定。Wallenhammar等成功利用巢式PCR對天然病土進行檢測[28]。Sundelin等利用根腫菌侵染后產(chǎn)生的特異性脂肪酸——花生四烯酸（20 ∶4），對土壤及植物組織中的根腫菌進行定量檢測[29]。Wallenhammar等又利用熒光定量PCR技術(shù)檢測出土壤中有休眠孢子3 000個/g[30]。目前，國內(nèi)在根腫菌分子檢測方面也取得了較快的進展。楊佩文等設(shè)計了1對核糖體基因ITS區(qū)段的特異性引物，成功用于不同寄主根腫菌的檢測[31]。尹全等根據(jù)GenBank上已發(fā)表的根腫病菌基因片段序列設(shè)計了1對特異性引物，有效、快速地檢測病原菌[32]。李金萍等通過熒光定量PCR的方法檢測出土壤中有休眠孢子 1 000個/g[33]。這些分子檢測技術(shù)為精確預(yù)測田間病害的發(fā)生趨勢、病菌分布及病害防治提供了可靠的依據(jù)。

3.2根腫菌的分子致病機理

根腫菌是一種非常重要的專性寄生致病菌，明確其致病分子機理，對培育抗性新品種及病害防治具有重要意義。由于病原菌基因組信息相當少，GenBank數(shù)據(jù)庫僅公布了根腫菌的200多個核苷酸序列。Bulman等利用SSH技術(shù)（supression substractive hybridization）和RACE（rapid amplification of cDNA ends）技術(shù)成功克隆了76個基因的全長或部分序列[34]。目前，已報道的一些功能基因包括Y10、PbTPS、PbSTKL1、PbBrip9、PbCC249、PRO1[35]。Ito等首次利用RNA指紋技術(shù)（RNA finger printing）和Northern blot技術(shù)，分離和克隆到1個在根腫菌營養(yǎng)生長階段特異表達的基因Y10[36]。Brodmann等研究發(fā)現(xiàn)根腫菌侵染寄主時，其海藻糖-6-磷酸合成酶（由PbTPS編碼）生成大量的海藻糖，影響寄主植物的代謝和生長[37]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們通過各種方法尋找侵染過程中的差異表達基因。Ando等利用差異篩選分析法（Differential display analysis）鑒定到1個PbSTKL1基因，該基因編碼類絲氨酸/蘇氨酸激酶，在根腫菌侵染寄主30 d后表達量顯著增加[38]。Siemens等通過選取不同的侵染點，檢測了12個cDNAs的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PbBrip9和 PbCC249 在根腫菌侵染寄主過程中顯著表達[39]。最近，F(xiàn)eng等鑒定并克隆到1個絲氨酸蛋白酶Pro1，該蛋白屬于S28蛋白酶家族，具有蛋白酶水解活性，能夠促進休眠孢子的萌發(fā)[40]。隨后，F(xiàn)eng等又利用Dot blot和Real-time PCR分析比較，發(fā)現(xiàn)在根腫菌次級游動孢子階段存在著許多上調(diào)和下調(diào)表達的基因，進一步闡明了根腫菌存在初級侵染和次級侵染2種不同的侵染機制[41]。最近，F(xiàn)eng等在根腫菌分子致病機理方面又有了新的突破[42]。首次通過PEG介導的方法將綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）導入根腫菌菌株中并進行了PCR驗證，轉(zhuǎn)化效率約達到50%，但轉(zhuǎn)化菌株中未觀察到綠色熒光。近年來，國內(nèi)外雖然在根腫病分子致病機理方面的研究有所進展，但是對致病相關(guān)基因報道的較少，特別是在侵染過程中如何表達和調(diào)控的仍不清楚。

4根腫病的防治

4.1抗病品種的選育

根腫病是十字花科作物的重要病害之一，大多數(shù)作物品種對根腫病都是高感的。因此，大多數(shù)育種學家期望通過鑒定抗根腫病的R基因達到培育抗病品種的目的。研究表明R基因是一個多基因家族，這些家族蛋白能夠識別效應(yīng)因子并激發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)，產(chǎn)生過敏反應(yīng)。最近研究發(fā)現(xiàn)蕓薹屬作物B. rapa含多個抗根腫病CR基因和1～2個數(shù)量性狀位點（QTL）[35]。Voorrips報道一些抗根腫菌的甘藍（B. oleracea），隨后又從B. oleracea上發(fā)現(xiàn)了2個抗根腫病的數(shù)量性狀位點pb-3和pb-4[43]。另外，Manzanares-Dauleux從甘藍型油菜上分離到1個抗性基因Pb-Bn1[44]。目前，雖然已有一些商品化的抗性品種，但是單基因抗性強，對病菌的選擇壓力大，根腫菌易出現(xiàn)遺傳和致病力的變化，促進新小種的出現(xiàn)，導致有些抗性品種容易失去抗性，因此不斷篩選和培育具有多個抗性的新品種是今后防治根腫病的目標。

4.2農(nóng)業(yè)措施

目前，防治根腫病的農(nóng)業(yè)措施包括3個方面。一是土壤處理，通過改良土壤，改變土壤酸堿度，以降低根腫病發(fā)病率[45]。鈣鹽處理既可以調(diào)節(jié)土壤的pH值，又可以增加土壤中可交換Ca2+ 的濃度從而減輕病菌的危害[46]。在整地施肥時，結(jié)合增施熟石灰、草木灰或蛋殼粉等堿性物質(zhì)，改變土壤酸性狀況[47]。另外，研究表明硼處理能夠減少根腫病的發(fā)生概率[48]。二是加強田間管理，農(nóng)用機械和設(shè)備使用后要及時清理、消毒，園區(qū)徹底清除病殘體并燒毀。三是輪作，與非十字花科作物輪作3年以上，能有效減輕根腫病的發(fā)生[49]。

4.3化學防治

據(jù)報道，五氯硝基苯、氟啶胺、甲基二硫代氨基甲酸鈉、氰霜唑、百菌清等化學藥劑對根腫病均有一定的防效[50-51]。播種前用化學藥劑對種子、苗床、土壤進行消毒處理，對根腫病有一定的防治效果。大田試驗表明50%氟啶胺和10%氰霜唑?qū)Π撞烁[病具有較好的防治效果[52]。孫道旺等發(fā)現(xiàn)用75%百菌清于苗期灌根2次能有效地防治白菜根腫病，且無農(nóng)藥殘留[53]。李妍等比較灌根法和拌藥法對白菜根腫病的防效，發(fā)現(xiàn)50%氟啶胺懸浮劑拌藥處理的防效更好[54]。

4.4生物防治

除了選育抗病品種、化學防治、農(nóng)業(yè)措施等手段防治根腫病外，生物防治成為目前防治的一個重要手段。多年來，人們對生防菌的生防應(yīng)用、生物藥劑的開發(fā)及生防機制做了大量嘗試和深入的研究。有研究表明，土壤中的生物拮抗菌對根腫菌的防治效果明顯。其中生防真菌主要有莖點霉屬真菌Phoma glomerata[55]、木霉菌Trichoderma（TC32、TC45、TC63）[56]、枝頂孢屬真菌Acremonium alternatum[57]、粘帚菌Gliocladium catenulatum[58]以及大白菜根部的一種內(nèi)生真菌Heteroconium chaetospira[59]。已有研究表明，利用生防細菌和放線菌對防治根腫病也有一定效果。如細菌類枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis QST713）[60]、枯草芽孢桿菌（B. subtilis XF-1）[61]以及放線菌Streptomyces isolate S99[56]、Microbispora rosea subsp. rosea（A004、A011）[62]、Streptomyces olivochromogenes（A018）[62]、Streptomyces griseorube（A316、A10）[63]和YN-6[64]都可以有效地控制根腫病。目前，一些生防菌已被開發(fā)和商品化生產(chǎn)，為根腫病的防治提供了新的方向。

5問題與展望

5.1從分子水平上檢測根腫病菌

由于根腫菌具有不同于其他物種的特性，利用分子生物學方法鑒定病原菌將是未來發(fā)展的趨勢，有利于及時控制病原菌的傳播及制定有效的防治策略。近年來，分子檢測技術(shù)從最初的普通PCR發(fā)展到熒光定量PCR[65]，然而，分子檢測技術(shù)特別是熒光定量PCR技術(shù)對引物靈敏度和精確度的要求比常規(guī)PCR更高。目前，基于新靶標序列建立的檢測體系為病原菌的檢測應(yīng)用提供了理論依據(jù)和方向。例如，用來檢測大豆枯萎病的甾醇14α-去甲基化酶基因（Sterol 14α-de-methylase，CYP51C）的特異序列，相比rDNA-ITS、β-tubulin序列，更加快速、高靈敏度、穩(wěn)定[66]。因此，利用高度保守的基因序列作為分子檢測的新靶標建立根腫菌的快速檢測體系，可以為持續(xù)高效控制根腫病提供可靠且準確的鑒定方法。

5.2加深對根腫菌分子致病機理的研究

由于根腫菌全基因組信息不足，遺傳轉(zhuǎn)化困難，因此分子致病機理研究進展十分緩慢。近年來，國外對根腫菌致病機制的研究取得了很大的進展。根腫菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，進一步加深了對根腫菌致病分子機制的理解，極大地促進了根腫病致病系統(tǒng)中多領(lǐng)域的研究。目前運用分子生物學手段鑒定致病相關(guān)基因已經(jīng)越來越方便，例如SSH技術(shù)、Dot-blot 技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)等。Feng等研究表明根腫病菌存在初級侵染和次級侵染2種不同的侵染機制[41]。因此，研究侵染過程各階段重要基因的功能，可為藥劑研發(fā)提供潛在的分子靶標，為篩選新的抗源和制定新的控制策略提供重要的指導意義。

5.3生物防治是未來防治的一大趨勢

根腫病的防治一直是國內(nèi)外研究的重點和熱點。目前，防治根腫病的措施很多，其中化學防治和種植抗病品種是防治根腫病的重要手段。但是，由于該病原菌生理小種的多樣性和易變性，導致抗病品種推廣數(shù)年后易失去抗性，而目前化學藥劑防效不佳，同時長期大量使用化學農(nóng)藥增加了十字花科作物體內(nèi)有毒物質(zhì)的積累和殘留，給人類健康帶來危害。利用生物防治不僅避免了這一系列問題，而且安全、有效，在植物病害防治中已經(jīng)成為一種十分重要且有效的措施。然而，生物防治也有一定的局限性，如容易受到環(huán)境因素的影響，作用效果不如化學防治明顯。因此，應(yīng)不斷加深生防菌生防機制的研究，提高生防菌的生防效果和穩(wěn)定性，為生物防治帶來新的契機和應(yīng)用前景。

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