康華軍 李建設(shè) 高艷明 史 娟 石延霞 謝學(xué)文 李 磊 范騰飛 李寶聚* 柴阿麗*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 寧夏大學(xué)，寧夏銀川 750021；3 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州 730070）

寧夏地處我國西北地區(qū)東部，黃河上中游，地勢南高北低，呈階梯狀下降，平均海拔1 000 m 以上。區(qū)內(nèi)日照時間長，光能資源豐富，晝夜溫差大，灌溉便利，適宜發(fā)展設(shè)施蔬菜。番茄（）原產(chǎn)于南美洲，為茄科一年生或多年生草本植物。番茄果實(shí)富含胡蘿卜素、維生素、番茄紅素、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)，能減少心臟病發(fā)作，可抗癌防癌，降低血壓，延緩衰老，防治動脈硬化等。因其營養(yǎng)豐富，而且具有保健功能，已成為世界上最重要的蔬菜作物之一（夏冬，2014）。目前，寧夏已經(jīng)成為我國重要的設(shè)施番茄生產(chǎn)基地，其栽培面積約占寧夏設(shè)施蔬菜總面積的26.5%（沙龍 等，2013）。隨著番茄栽培面積的不斷擴(kuò)大，病害的發(fā)生范圍也越來越廣，嚴(yán)重阻礙了番茄的正常生產(chǎn)。

番茄病毒病是影響番茄安全生產(chǎn)的重要限制因素，已發(fā)現(xiàn)可以侵染番茄的病毒至少有136 種（Xu et al.，2017）。目前，已報道的侵染我國番茄的常見病毒有20 多種，如番茄褪綠病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）、番茄斑駁花葉病毒（tomato mottle mosaic virus，ToMMV）、番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）等（劉勇 等，2019）。2011年，寧夏銀川市園藝產(chǎn)業(yè)園首次發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）（沙龍等，2013），2016 年石嘴山市發(fā)生了番茄斑萎病毒?。╰omato spotted wilt virus，TSWV）（曹金強(qiáng) 等，2016）。許多病毒在侵染番茄后表現(xiàn)出類似的癥狀，且田間也經(jīng)常發(fā)生多種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象，因此難以通過肉眼觀察判斷病毒的種類。近些年分子生物學(xué)方法以其快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地用于植物病毒的鑒定和診斷。

本試驗(yàn)對在寧夏銀川地區(qū)采集到的番茄病毒病樣本進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以明確引起寧夏番茄病毒病的病毒種類，為有針對性地防控該病害的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021 年8 月，在寧夏銀川地區(qū)設(shè)施番茄生產(chǎn)基地調(diào)查了番茄病毒病發(fā)生情況，采集10 份番茄植株莖稈、葉柄和未成熟果實(shí)帶有褐色病斑等癥狀的植物樣本，分別裝在干凈的采集袋中，置于冰上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱。

植物總RNA 提取試劑：Trizol、氯仿∶異戊醇（24∶1）、異丙醇、75%乙醇、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript ? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit〔購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司〕、2×Master Mix（Dye Plus）（購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 供試引物

本試驗(yàn)所使用番茄病毒病分子檢測特異性引物共23 對，引物信息見表1。

表1 番茄病毒病分子檢測的引物信息

續(xù)表

1.3 植物總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

取發(fā)病的葉柄、莖稈和果實(shí)樣本，加液氮研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，加入1 mL Trizol，充分混勻；4 ℃、12 000 r·min離心5 min，取上清液移入另一個1.5 mL 離心管中；加入1/5 體積氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻；4℃、12 000 r·min離心10 min，取上清液移入另一個1.5 mL 離心管中；加入等體積異丙醇，充分混勻；4 ℃、12 000 r·min離心10 min，倒掉上清液保留沉淀；用1 mL 75%乙醇漂洗，4 ℃、8 000 r·min離心10 min，倒掉上清液保留沉淀；晾干后，加入ddHO 50 μL。RNA 經(jīng)定量后放入-80 ℃冰箱保存，備用。

以番茄感病樣本總RNA 為模板，使用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 RT-PCR 檢測

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 分別利用番茄常見病毒病特異性引物（表1）進(jìn)行檢測。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：各0.5 μL 上、下游引物，1 μL模板cDNA，10 μL 2×Master Mix（Dye Plus），ddHO 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。將PCR 產(chǎn)物送至博邁德基因技術(shù)有限公司（北京）進(jìn)行測序。利用NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）序列比對，根據(jù)同源性確定病毒種類。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

保存BLAST 序列比對結(jié)果中相應(yīng)分離物的序列。利用MEGA 6.0 軟件，對保存的序列進(jìn)行分析。多序列比較分析采用ClustalW，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，重復(fù)1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄病株的田間癥狀

2021 年寧夏地區(qū)溫室內(nèi)番茄病毒病嚴(yán)重發(fā)生，主要癥狀包括：植株的葉柄和莖稈出現(xiàn)褐色、不規(guī)則形病斑，病斑大小不等，發(fā)病嚴(yán)重時病斑可繞莖一周（圖1-A、B）；未成熟果實(shí)表面出現(xiàn)褐色、不規(guī)則形病斑，隨著病情發(fā)展發(fā)病部位逐漸壞死、變硬，略微凸起，部分果實(shí)出現(xiàn)條紋或同心環(huán)紋（圖1-C、D）。

圖1 番茄病毒病植株田間癥狀

2.2 番茄病株樣品的RT-PCR 檢測

提取10 份番茄病株樣品的總RNA，以其為模板，利用不同番茄病毒的特異性引物進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增。結(jié)果表明：只有引物STVdF/STVdR和TSWV-F/TSWV-R 分別擴(kuò)增出大小約為681 bp 和777 bp 的特異片段（圖2），其他引物均未擴(kuò)增出特異片段。測序后經(jīng)BLAST 比對，大小約為681 bp 特異片段的分離物與GenBank 上的南方番茄病毒（southern tomato virus，STV）的相似性達(dá)到100%，大小約為777 bp 特異片段的分離物與GenBank 上的TSWV 的相似性達(dá)到99%以上。表明寧夏銀川地區(qū)番茄被STV 與TSWV 復(fù)合侵染。

圖2 不同引物對番茄病毒病樣本RT-PCR 檢測結(jié)果

2.3 TSWV 和STV 聚類分析結(jié)果

將所得的TSWV 和STV 分離物的擴(kuò)增子序列與GenBank 中TSWV 和STV 相應(yīng)分離物序列進(jìn)行比對，并選擇其他地區(qū)與本試驗(yàn)中的序列最為接近的TSWV 和STV 分離物，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，寧夏銀川地區(qū)番茄上的TSWV 與西班牙辣椒上TSWV 分離物聚在同一分支上，表明進(jìn)化關(guān)系最近，而與其他地區(qū)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；STV分離物與法國、巴基斯坦、哥倫比亞番茄上的STV分離物的進(jìn)化關(guān)系最近，與其他地區(qū)的STV 分離物關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于TSWV（A）和STV（B）基因組部分核酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

采用RT-PCR 方法對采集自寧夏銀川地區(qū)的疑似番茄病毒病的植株樣品進(jìn)行了鑒定，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明這些番茄被TSWV 和STV復(fù)合侵染。寧夏銀川地區(qū)番茄上的TSWV 分離物的進(jìn)化關(guān)系與西班牙辣椒上的TSWV 分離物進(jìn)化關(guān)系最近，STV 與法國、巴基斯坦和哥倫比亞番茄上的STV 分離物關(guān)系最近。

TSWV 屬于，可以侵染900 多種植物（包括農(nóng)作物與雜草），如花生、辣椒、馬鈴薯、煙草、番茄、芹菜、南瓜和桔梗等（李云洲 等，2018），在我國許多地區(qū)均有TSWV 的為害（李潔等，2017），并且該病毒已經(jīng)被列入中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄。TSWV 侵染苗期番茄引起生長點(diǎn)和葉片變成銅色并上卷，隨后出現(xiàn)黑斑點(diǎn)，葉片背面葉脈呈紫色，后期引起生長點(diǎn)和葉片壞死，整株萎蔫，果面有環(huán)狀病斑，尤其是果實(shí)完全成熟時病斑表型非常明顯（Chiemsombat &Adkins，2006；李潔 等，2017；王凱娜 等，2019；李婷婷 等，2020；石巖 等，2020）。據(jù)報道，TSWV 只能通過機(jī)械傳播和昆蟲傳播，不能通過種子傳播（李云洲 等，2018）。

STV病毒是近些年新發(fā)現(xiàn)和命名的一種病毒，屬于Amalgaviridae 科屬。目前已在美國、墨西哥、法國、西班牙、德國和中國等地區(qū)發(fā)現(xiàn)了STV，主要癥狀包括植株生長矮小，黃化，生長點(diǎn)壞死，果實(shí)較小，出現(xiàn)環(huán)形斑點(diǎn)等（Turina et al.，2007；Candresse et al.，2013；Gaafar et al.，2019）。除侵染番茄外，STV 還可以侵染藍(lán)莓、紫荊花以及杜鵑花等植物（蘇海娣，2013）。與TSWV 不同的是，STV 是嚴(yán)格的種傳病毒，不能通過汁液摩擦和嫁接傳播，也沒有發(fā)現(xiàn)通過昆蟲傳播（董云浩 等，2019）。

絕大多數(shù)病毒都是系統(tǒng)侵染植物，并且許多病毒侵染植株后出現(xiàn)了類似的發(fā)病癥狀，導(dǎo)致人們難以準(zhǔn)確識別病毒的種類。在田間，多種病毒同時侵染植株的情況時有發(fā)生，更是增加了診斷難度。基于分子生物學(xué)的方法對病毒的種類進(jìn)行鑒定，可以有效避免以上問題。目前，對田間植物病毒的鑒定越來越依賴于分子診斷。劉微等（2018）通過RTPCR 方法對云南元謀地區(qū)的疑似番茄病毒病進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)該地的番茄被番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染。Xu 等（2017）對我國的170個番茄樣品進(jìn)行了小RNA 測序分析，共檢測到了22 種病毒，其中大多數(shù)樣品是被多種病毒共同侵染，同時認(rèn)為STV 已經(jīng)成為我國番茄上第四大流行病毒。鑒于兩種病毒傳播方式有所不同，在生產(chǎn)中應(yīng)注意采取綜合措施進(jìn)行防治，既要加強(qiáng)種子檢疫和種子消毒，同時也要注意防治昆蟲。