崔嘉琪，孫蓉蓉，張 燦，劉文華，鄒 玲，任慧英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

早在上世紀(jì)30～40 年代噬菌體就被用于治療細菌感染，但隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)，因其高效殺菌、使用方便、價格便宜的特點，抗生素很快在世界各地得到廣泛應(yīng)用，逐漸代替了噬菌體。近年來，由于抗生素的濫用致使細菌耐藥性產(chǎn)生甚至不斷出現(xiàn)了多重耐藥菌，尋找抗生素的替代品是目前的當(dāng)務(wù)之急。噬菌體是能夠特異性感染細菌的病毒[1]，具有特異性的宿主識別譜，可實現(xiàn)對細菌的快速特異殺滅，其殺菌作用不受細菌耐藥性的限制，且噬菌體具有研發(fā)周期短、投入成本低、安全性高等優(yōu)點，成為最有影響力的抗生素替代品之一[2-3]。因此噬菌體療法的研究及臨床應(yīng)用逐漸得到重視。

在細菌與噬菌體共同進化過程中，細菌不斷演化出抵抗噬菌體的機制，噬菌體抗性菌的出現(xiàn)成為噬菌體治療中的難題[4]，噬菌體的抗性菌會不會像抗生素抗性菌一樣最終面臨無藥可治的境地？噬菌體抗性細菌的出現(xiàn)往往與細菌的自發(fā)突變和適應(yīng)性有關(guān)，且往往與噬菌體吸附受體的修飾有關(guān)。主要的噬菌體抗性機制是噬菌體抗性菌株能夠通過表面修飾對噬菌體進行防御[5]。樂率研究發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌通過細胞表面外膜脂多糖的丟失從而產(chǎn)生了噬菌體抗性，且抗性菌的毒力顯著下降[6]。本實驗室前期分離到一株大腸桿菌噬菌體Bp4，屬于短尾噬菌體科N4 類噬菌體，能夠裂解O78 血清型的大腸桿菌。本研究通過雙層平板法篩選大腸桿菌噬菌體的抗性突變株，將其與大腸桿菌敏感菌株進行了形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察、血清型及耐藥性檢測、基因組測序分析等研究，以期為噬菌體治療中噬菌體抗性菌的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料大腸桿菌噬菌體Bp4、大腸桿菌血清O78 型敏感菌株（后簡稱O78 型敏感菌株）均由本實驗室保存；BALB/c 小鼠購自青島大任富城畜牧有限公司。營養(yǎng)瓊脂、LB 肉湯、瓊脂粉均購自生工生物工程（上海）有限公司；大腸桿菌O 抗血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 噬菌體抗性突變菌株的篩選與鑒定將噬菌體Bp4 的宿主菌（O78 型敏感菌株）接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃220 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后取200 μL 與200 μL 噬菌體Bp4 的增殖液一起加入5 mL LB 中，37 ℃220 r/min 振蕩培養(yǎng)，觀察液體的渾濁狀態(tài)；在約3 h 液體清亮后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)過夜至渾濁，用接種環(huán)采用三線法將該噬菌體增殖液接種于LB 平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。將LB 平板上長出的單菌落連續(xù)純化4 代，將第4 代純培養(yǎng)的單菌落再與噬菌體Bp4 經(jīng)液體培養(yǎng)后再經(jīng)雙層平板法培養(yǎng)[7]，即用接種環(huán)挑取第4 代純培養(yǎng)的單菌落接種于5 mL LB 中，37 ℃220 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取110 μL 菌液與110 μL 噬菌體Bp4 增殖液混勻后于37 ℃孵育5 min，取200 μL 孵育液加至已溶解的上層瓊脂中，混勻后迅速傾倒在下層營養(yǎng)瓊脂上，晃勻待凝固后37 ℃倒置培養(yǎng)6 h～8 h，設(shè)不加噬菌體的敏感菌株為陽性對照。觀察噬菌斑產(chǎn)生情況，不產(chǎn)生噬菌斑的菌株即為對噬菌體Bp4 具有抗性的大腸桿菌突變菌株，命名為大腸桿菌O78-R 型抗性菌株（后簡稱O78-R 抗性菌株）。

1.3 敏感菌株與抗性菌株的形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察將O78 型敏感菌株與O78-R 抗性菌株分別在普通營養(yǎng)瓊脂及麥康凱瓊脂上劃線培養(yǎng)，37 ℃16 h 后觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色觀察。挑取單菌落于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃220 r/min 振蕩過夜培養(yǎng)，利用傾注平板法[8]測定菌液濃度：將菌液10 倍倍比稀釋至107倍，分別選取105和107稀釋度的菌懸液各1 mL 于無菌培養(yǎng)皿中，然后將約50 ℃營養(yǎng)瓊脂注入平板中晃勻，試驗重復(fù)兩次；待瓊脂凝固后，將平板倒置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h 左右，經(jīng)細菌計數(shù)評估兩種細菌的生長速度。

1.4 敏感菌株與抗性菌株的基因組測序及序列分析將純化的O78 型敏感菌株及O78-R 抗性菌株由北京安諾優(yōu)達基因科技有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果分析比較抗性菌株與敏感菌株基因組的差異。

1.5 敏感菌株與抗性菌株的血清型鑒定將O78 型敏感菌株與O78-R 抗性菌株分別接種于5 mL LB 肉湯中，37 ℃220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h 后，4 000 r/min離心10 min，棄上清，用0.5%石炭酸生理鹽水2 mL懸浮后121 ℃高壓2 h，以破壞細菌的莢膜“K”抗原，制成高壓抗原，以大腸桿菌O 抗血清為抗體，利用玻板凝集法鑒定大腸桿菌的“O”抗原血清型。

1.6 敏感菌株與抗性菌株的耐藥性檢測參照文獻[9]采用藥敏K-B 紙片法分別檢測O78 型敏感菌株及O78-R 抗性菌株對12 種藥物的敏感性，根據(jù)歐盟藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.7 敏感菌株與抗性菌株的致病性試驗將20 只BALB/c 小鼠隨機分為兩組，每組10 只，分別腹腔注射O78 型敏感菌株新鮮菌液及O78-R 抗性菌株新鮮菌液0.2 mL（菌液濃度均為1×108cfu/mL），統(tǒng)計感染后72 h 內(nèi)兩組小鼠的發(fā)病率和死亡率，并統(tǒng)計感染后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 時每組小鼠的臨床癥狀得分，判定標(biāo)準(zhǔn)為：死亡0 分，瀕臨死亡1分，部分閉眼、眼周有滲出液2 分，嗜睡、弓背3分，運動減少、被毛粗亂為4 分，正常、健康者5分，繪制患病小鼠的計分及其存活率曲線。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體抗性菌株的篩選與鑒定結(jié)果分別取200 μL 培養(yǎng)至對數(shù)期的O78 型敏感菌株菌液及噬菌體Bp4 增殖液于5 mL 肉湯中，振蕩培養(yǎng)，可觀察到液體從清亮-渾濁-清亮-渾濁的變化，取最后渾濁的液體劃線傳代，用噬菌體Bp4 再感染第4 代的菌液，液體一直處于渾濁狀態(tài)，初步判斷噬菌體Bp4不再感染該菌株；用第4 代的菌液與噬菌體Bp4 經(jīng)雙層平板培養(yǎng)6 h～8 h 不再產(chǎn)生噬菌斑，而O78 型敏感菌株的平板則產(chǎn)生了明顯的噬菌斑（圖1）。表明宿主菌（敏感菌株O78 型）在與噬菌體Bp4 相互作用中產(chǎn)生了對噬菌體Bp4 耐受的菌株，即抗性菌株O78-R。

圖1 噬菌體Bp4抗性菌株的篩選與鑒定結(jié)果Fig.1 Screening and identification of E.coli strains resistant to phage Bp4

2.2 敏感菌株與抗性菌株的形態(tài)及培養(yǎng)特性結(jié)果將抗性菌株與敏感菌株進行了形態(tài)及培養(yǎng)特性的比較，發(fā)現(xiàn)兩株菌的菌落形態(tài)相同，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上均呈表面光滑、半透明的單菌落（圖2），在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色小菌落，表面光滑。且抗性菌株與敏感菌株的生長速度相同，105稀釋度的兩株菌菌懸液生長的單菌落數(shù)量太多不予計數(shù)，107稀釋度兩株菌的菌懸液在37 ℃培養(yǎng)24 h 時均生長出30 個單菌落，且重復(fù)實驗結(jié)果相同。表明，抗性菌株與敏感菌株的形態(tài)及培養(yǎng)特性相同，生長速度一致。

圖2 O78敏感菌株與O78-R抗性菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Culture results of O78 sensitive strain and O78-R resistant strain in common nutrient agar medium

2.3 敏感菌株與抗性菌株基因組差異的分析將敏感菌株與抗性菌株分別測序。結(jié)果顯示，O78 型敏感菌株與O78-R 抗性菌株基因組全長均為4 798 435 bp。兩組測序數(shù)據(jù)的比對分析結(jié)果顯示，抗性菌株中有3 個堿基發(fā)生突變，分別位于3 個重疊群（contig）中（表1）。

表1 顯示，3 個堿基的突變涉及到3 個氨基酸，分別為乙醛脫氫酶的N→Y，十一碳二烯磷酸α-N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶1 的W 發(fā)生無義突變，以及UpfB 蛋白L 發(fā)生同義突變。致噬菌體發(fā)生抗性的原因很可能為contig00024 中65 018 nt 處的堿基突變，密碼子由TGG 變?yōu)門AG，編碼的氨基酸由色氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，從而致蛋白質(zhì)翻譯提前終止，致使抗性菌株的葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶由敏感菌株的372 個氨基酸縮短為133 個氨基酸，不能執(zhí)行正常的酶功能（圖3）。

表1 抗性菌株突變點的信息Table 1 Annotation for mutantion sites of the resistant strain

圖3 敏感菌株O78與抗性菌株O78-R氨基酸序列比對Fig. 3 Comparison of amino acid sequence between the sensitive strain O78 and resistant strain O78-R

2.4 敏感菌株與抗性菌株的血清型鑒定采用玻板凝集法對O78 型敏感菌株及O78-R 抗性菌株進行血清型鑒定，結(jié)果顯示，O78 型敏感菌株與O78 抗血清呈明顯的凝集現(xiàn)象，液滴邊緣出現(xiàn)麩皮樣顆粒狀的凝集片，液體清亮；O78-R 抗性菌株與O78 抗血清的凝集現(xiàn)象不明顯，液體渾濁，且有少量細微顆粒。表明敏感菌株確為O78 血清型，而抗性菌株血清型發(fā)生了改變，已不能鑒定為O78 血清型。

2.5 敏感菌株與抗性菌株的藥敏試驗采用藥敏紙片法分別檢測O78 型敏感菌株與O78-R 抗性菌株的藥物敏感性。結(jié)果顯示，與敏感菌株相比，O78-R抗性菌株對替米考星、環(huán)丙沙星、氨曲南、妥布霉素的抑菌圈直徑增大，耐藥性降低（表2），表明噬菌體抗性菌株比其敏感菌株對以上抗生素更敏感。

表2 藥敏試驗結(jié)果Table 2 Results of drug sensitivity test

2.6 敏感菌株與抗性菌株對小鼠的致病性試驗結(jié)果將敏感菌株與抗性菌株的增殖液經(jīng)腹腔接種小鼠，記錄小鼠的體況計分及存活率。結(jié)果顯示，抗性菌株接種的小鼠未出現(xiàn)死亡，在感染后0～48 h 小鼠體況計分一直維持在45 分以上，之后略有下降（圖4A）；而敏感菌株接種的小鼠在接種后72 h 內(nèi)共死亡4只，體況計分比抗性菌株接種的小鼠約低30分（圖4B），表明噬菌體抗性菌株對小鼠的致病性降低。

圖4 兩組小鼠的體況計分（A）及存活率（B）統(tǒng)計結(jié)果Fig.4 Statistical results of body condition score(A)and survival rate(B)of two groups of mice

3 討 論

為了研究噬菌體的抗性突變大腸桿菌菌株與其敏感菌株的差異，本研究經(jīng)雙層平板法篩選出對噬菌體具有抗性的大腸桿菌突變菌株，雖然在形態(tài)及培養(yǎng)特性上該抗性菌株與其敏感菌株未表現(xiàn)出差異，但該抗性菌株不再與O78 抗血清發(fā)生強陽性的凝集反應(yīng)，不再屬于O78 血清型。

基因組測序及分析結(jié)果顯示，敏感菌株與抗性菌株基因組的全長一致，證明抗性菌株并無基因缺失和插入，但在抗性菌株中出現(xiàn)3 處堿基的突變，導(dǎo)致1 個同義突變，1 個氨基酸替換（乙醛脫氫酶）以及1 個無義突變。乙醛脫氫酶負責(zé)催化乙醛氧化為乙酸的反應(yīng)，參與細菌的代謝，與噬菌體的感染無關(guān)。無義突變導(dǎo)致抗性菌株的十一碳二烯磷酸α-N-乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶1 的翻譯提前終止，而該蛋白參與細菌外膜中脂多糖O 抗原的生物合成途徑[10]，導(dǎo)致脂多糖O 抗原的合成受到抑制，提示該蛋白的突變是導(dǎo)致噬菌體不能感染抗性菌株的原因。本研究所用的噬菌體Bp4 屬于短尾噬菌體科，為N4 類噬菌體[11]，短尾噬菌體中N4 類噬菌體G7C識別大腸桿菌表面的脂多糖受體[12]，T7 類噬菌體尾部蛋白識別的也是宿主菌表面的脂多糖受體[13]，推測脂多糖也是噬菌體Bp4 的受體。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細胞壁外膜中鑲嵌大量的脂多糖[14]。革蘭氏陰性菌的脂多糖由3 部分組成：從內(nèi)向外依次為脂質(zhì)A、核心多糖、多糖側(cè)鏈，多糖側(cè)鏈又稱為O-抗原，當(dāng)脂多糖中的任何一部分缺失均會對脂多糖的合成造成影響。本實驗中篩選的抗性菌株是由于堿基突變導(dǎo)致了色氨酸變?yōu)榻K止密碼子，致脂多糖中參與O 抗原生物合成的N-乙酰葡萄糖胺磷酸轉(zhuǎn)移酶的翻譯提前終止。通過凝集試驗鑒定敏感菌株與抗性菌株的O 抗原，結(jié)果顯示敏感菌株為典型的O78 血清型，而抗性菌株不再與O78 抗血清發(fā)生凝集，不能鑒定為O78 血清型。該結(jié)果證實O 抗原是噬菌體Bp4 識別并吸附宿主菌的關(guān)鍵受體。大腸桿菌的O 抗原類型與其致病性有直接相關(guān)性，每株大腸桿菌只含有一種O 抗原，能致雞大腸桿菌病的常見血清型為O1、O2、O35 及O78[15]。本研究獲得的噬菌體抗性菌不再具有O78 抗血清的凝集性，提示細菌的致病性可能下降。樂率等通過對銅綠假單胞菌PA1 株與噬菌體的相互作用，篩選出抗性菌株P(guān)A1r 并做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)抗性菌株可以分泌紅色素，且致病性下降[6]。噬菌體抗性菌株致病性的下降已被多項研究所證實[4,16]，本研究經(jīng)腹腔注射敏感菌株小鼠的死亡率達到40%，而腹腔注射抗性菌株小鼠的死亡率為0，也證明了噬菌體抗性菌株致病性的下降。噬菌體抗性菌株致病性的下降會導(dǎo)致細菌在動物體內(nèi)更容易被免疫系統(tǒng)清除。

本研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體抗性菌株的耐藥性發(fā)生了改變，其對替米考星、環(huán)丙沙星、氨曲南、妥布霉素的抑菌圈直徑增大，比噬菌體敏感菌株的耐藥性降低，該結(jié)果與Jalasvuori 報道的結(jié)果類似[17]。噬菌體抗性菌株耐藥性的下降會導(dǎo)致其在較低的抗生素濃度下即可被殺死。

噬菌體抗性菌株產(chǎn)生的幾率大約為千萬分之一。細菌對噬菌體的抗性是相對的，其對一株噬菌體產(chǎn)生抗性，但還可以被其他的噬菌體感染。于玲等分離到對大腸桿菌具有抗性的噬菌體，并將其與原噬菌體混合制成新的噬菌體雞尾酒用于殺菌，結(jié)果表明，該噬菌體雞尾酒不僅具有明顯的殺菌效果，而且在體外降低了噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生和突變頻率[18]。

噬菌體抗性突變菌株的產(chǎn)生是細菌和噬菌體相互作用的結(jié)果，抗性菌株的產(chǎn)生必然會導(dǎo)致細菌基因組及表型的變化。本研究通過分析大腸桿菌短尾噬菌體Bp4 的抗性菌株和敏感菌株，發(fā)現(xiàn)抗性菌株的耐藥性和致病性均下降，說明噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生不會對噬菌體治療效果產(chǎn)生較多副作用，也為噬菌體治療中出現(xiàn)抗性菌問題的解決提供了參考依據(jù)。