紀(jì)玉潔，郭 興，張振宇，王曉鈞

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

B 型流感病毒（Influenza B virus，IBV）屬正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒屬，是有囊膜、分節(jié)段的負(fù)鏈RNA 病毒。IBV 感染宿主引起的呼吸系統(tǒng)癥狀通常較輕，兒童和老人較易感，可引發(fā)多種并發(fā)癥，影響肌肉、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等[1]。IBV 無(wú)亞型區(qū)分，根據(jù)病毒表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）的抗原性差異可分為Victoria 和Yamagata兩個(gè)譜系[2-3]。病毒核糖核蛋白體復(fù)合物（Viral ribonucleoprotein complexes，vRNP）作為病毒復(fù)制的最小單元，由RNA 依賴性RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）、核糖核蛋白（Nucleoprotein，NP）以及病毒RNA（Viral RNA，vRNA）組成，對(duì)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的有效復(fù)制至關(guān)重要，vRNP 在復(fù)制過(guò)程中相對(duì)保守，變異率低，是影響流感病毒宿主適應(yīng)性的關(guān)鍵因素[4-5]。

RdRp 作為一種異源三聚體復(fù)合物，目前仍無(wú)一種快速、高效的純化策略，同時(shí)也缺乏IBV RdRp 各亞基單克隆抗體（MAb）制備的相關(guān)報(bào)道。近期研究發(fā)現(xiàn)流感病毒宿主蛋白—ANP32 家族蛋白（酸性核磷酸蛋白32，主要包括ANP32A、ANP32B、ANP32E等）能夠與流感病毒RdRp 高效結(jié)合并支持流感病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，其羧基端結(jié)構(gòu)域?qū)@一高效結(jié)合發(fā)揮了重要作用[6-7]。本研究以此為理論基礎(chǔ)，利用表達(dá)融合有flag 標(biāo)簽的鼠ANP32B 羧基末端結(jié)構(gòu)域[muANP32B（111-C）-flag]的質(zhì)粒與表達(dá)IBV RdRp各亞基（PB1、PB2、PA）的質(zhì)粒，以免疫沉淀（IP）的方法純化IBV RdRp，將獲得的ANP32B（111-C）-RdRp 復(fù)合物作為免疫原免疫BALB/c 小鼠，經(jīng)間接ELISA 分別篩選出針對(duì)IBV PB1、PB2、PA 亞基及ANP32B（111-C）蛋白的MAb，并對(duì)獲得的4 株MAb的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析。為深入探究IBV RdRp 與宿主細(xì)胞的相互作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也提供了一種異源多聚體復(fù)合物純化及快速制備其各亞基MAb 的有效方法。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料pCAGGS-IBVYmPJ18PB1、pCAGGSIBVYmPJ18PB2、pCAGGS-IBVYmPJ18PA、pCAGGS-IBVYmPJ18NP、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PA-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-NP-His、pCAGGS-IBVVictoriaPB1-His、pCAGGSIBVVictoriaPB2-His、pCAGGS-IBVVictoriaPA-His、融合有His 標(biāo)簽的表達(dá)A、C、D 型流感病毒RdRp 各亞基的質(zhì)粒、融合有flag 標(biāo)簽的鼠、人、雞、牛、馬、豬、犬等物種表達(dá)ANP32 蛋白（包括ANP32A、ANP32B 及ANP32E）的質(zhì)粒、pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag、pCAGGS-flag 等質(zhì)粒及293T 細(xì)胞、SP2/0 細(xì)胞、MDCK 細(xì)胞、ANP32 基因雙敲除細(xì)胞（ANP32A/ANP32B double-knockout cells，DKO）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建或保存；IBV（B/Yamagata/PanJin/2018株，簡(jiǎn)寫為IBVYmPJ18，后續(xù)實(shí)驗(yàn)若未特別說(shuō)明均是指該株病毒）由本實(shí)驗(yàn)分離并保存；6 周齡SPF 級(jí)BALB/c 雌性小鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司；抗-flag M2 磁珠、融合劑PEG、HT Supplement（50×）、HAT Supplement（50×）、flag MAb、6×Histag MAb、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、Dy-Light 800TM標(biāo)記的羊抗鼠IgG、3×flag 多肽、TPCK 胰酶均購(gòu)自Sigma 公司；96 孔聚乙烯酶標(biāo)板購(gòu)自Costar公司；蛋白Marker 均購(gòu)自Thermo Fisher 公司；TMB顯色液、QuickAntibody-Mouse 3W（3 周標(biāo)準(zhǔn)鼠MAb/多克隆抗體制備佐劑）購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；HiTrap Protein G HP 抗體純化試劑盒購(gòu)自GE Healthcare 公司；商品化IBV NP 蛋白多克隆抗體購(gòu)自Gene Tex 公司；PolyJetTMin VitroDNA transfection reagent 購(gòu)自SignaGen 公司；Alexa Fluor488 山羊抗小鼠IgG 購(gòu)自Invitrogen 公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購(gòu)自Millipore 公司。

1.2 IBV ANP32B（111-C）-RdRp復(fù)合物表達(dá)與純化的IP 試驗(yàn)待DKO 細(xì)胞密度約80%時(shí)，利用PolyJet試劑將pCAGGS-IBVYmPJ18PB1、pCAGGS-IBVYmPJ18PB2、pCAGGS-IBVYmPJ18PA 和pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 等質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至該細(xì)胞，并設(shè)置表達(dá)人ANP32B蛋白的質(zhì)粒、表達(dá)小鼠muANP32B的質(zhì)粒分別替換上述試驗(yàn)中的pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 作為陽(yáng)性對(duì)照。8 h 后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，36 h 后裂解細(xì)胞，12 000 r/min 離心10 min 后取上清，加入抗-flag M2磁珠，4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床孵育2 h 后取出，PBS 充分洗滌后，加入3×flag 多肽，4 ℃旋轉(zhuǎn)搖床洗脫1 h 后收獲目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 分析目的條帶的大小及表達(dá)量。

1.3 MAb 的制備將1.2 IP 試驗(yàn)得到的IBV ANP32B（111-C）-RdRp 和QuickAntibody-Mouse 3W 快速佐劑等體積混勻，以頸背部皮下多點(diǎn)注射（20 μg/只）的方式免疫BALB/c 雌性小鼠，以上述方法每隔兩周進(jìn)行第2 次和第3 次免疫。第2 次免疫后尾靜脈采血，通過(guò)間接ELISA 方法[8]檢測(cè)血清效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到1∶12 800 以上時(shí)，注射上述復(fù)合物（100 μg/只）加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫3 d 后，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞在PEG 作用下融合。融合后培養(yǎng)至第10 d，利用上述間接ELISA 方法檢測(cè)抗體效價(jià)，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并通過(guò)有限稀釋法經(jīng)過(guò)3 次克隆純化，直至篩選出能夠穩(wěn)定分泌IBV RdRp 特異性MAb 的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。

利用PolyJet 分別將質(zhì)粒pCAGGS-IBVYmPJ18PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18PAHis、pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 轉(zhuǎn)染DKO 細(xì)胞。24 h 后裂解細(xì)胞，取上清經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，以DyLight 800TM標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000）為二抗，利用western blot 分別鑒定各陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株分泌MAb 所結(jié)合的RdRp亞基及與mANP32B（111-C）的反應(yīng)性。

從獲得的4 種類型的MAb 中各選取效價(jià)最高的1 株，將其雜交瘤細(xì)胞經(jīng)腹腔注射經(jīng)產(chǎn)BALB/c 小鼠（經(jīng)弗氏不完全佐劑預(yù)處理），約1.0×107個(gè)細(xì)胞/只，7 d～10 d 后采集腹水，小鼠腹水樣品經(jīng)離心過(guò)濾后，利用親和層析柱純化，-80 ℃保存。

1.4 MAb 效價(jià)的測(cè)定將純化后的各腹水用PBS（pH7.4）自1∶2 000 開始，2 倍倍比稀釋至1∶1.024×106并作為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，經(jīng)間接ELISA（以20μg/板的劑量包被純化的IBV RdRp 蛋白）測(cè)定MAb 的效價(jià)。

1.5 MAb 交叉反應(yīng)性的鑒定將293T 細(xì)胞鋪于六孔板中，并根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的種類將其分為A、B、C共3 組，待細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)分別用PolyJetTM轉(zhuǎn)染。A 組每孔分別轉(zhuǎn)染表達(dá)A 型流感病毒（Influenza A virus，A/Sichuan/01/2009 株：IAVSC09）、IBV（IBVVictoria和IBVYamagata）、C 型流感病毒（Influenza C virus，C/Victoria/02/2012 株：ICVVictoria）、D 型流感病毒（Influenza D virus， D/bovine/Yamagata/10710/2016株：IDVYamagata）RdRp 的PB1 單亞基蛋白的質(zhì)粒各1 μg；B 組和C 組分別轉(zhuǎn)染上述病毒株中表達(dá)PB2、PA 單亞基蛋白的質(zhì)粒；將DKO 細(xì)胞鋪于六孔板中并設(shè)置為D 組，每孔分別轉(zhuǎn)染融合有flag 標(biāo)簽的鼠、人、雞、牛、馬、豬、犬等物種表達(dá)的ANP32蛋白（包括ANP32A、ANP32B 及ANP32E）的質(zhì)粒各1 μg，并以轉(zhuǎn)染pCAGGS-flag 質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。8 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h 后裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min 后取上清，以各組對(duì)應(yīng)的小鼠純化腹水（1∶1 000）為一抗，以DyLight 800TM標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000）為二抗，采用western blot 分析制備的各亞基MAb 分別與A、B、C、組表達(dá)的各病毒RdRp 各亞基的交叉反應(yīng)性，及制備的ANP32 蛋白MAb 與各物種表達(dá)的ANP32 蛋白的反應(yīng)性。

1.6 利用MAb 對(duì)IBV 感染的MDCK 細(xì)胞及鼠源細(xì)胞中天然靶蛋白定位的激光共聚焦試驗(yàn)將MDCK細(xì)胞傳代至4 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度50%左右，將實(shí)驗(yàn)室保存的IBV 分別接種至上述4 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。2 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h；將SP2/0 細(xì)胞培養(yǎng)至密度約50%；將293T 細(xì)胞分別傳代至4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，分別轉(zhuǎn)染pCAGGS-IBVYmPJ18-PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PA-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-NP-His；將DKO 細(xì)胞傳代至1 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，轉(zhuǎn)染pCAGGS-mu-ANP32B-flag，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，作為上述試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。

將上述細(xì)胞分別用4%多聚甲醛固定30 min，0.05% Triton X-100 通透15 min， 5% 脫脂乳封閉1 h后，實(shí)驗(yàn)組中4 個(gè)接種IBV 的MDCK 細(xì)胞分別以IBV NP 蛋白多克隆抗體（1∶200）、本實(shí)驗(yàn)制備的PB1 MAb（1∶500）、PB2 MAb（1∶500）和PA MAb（1∶500）為一抗；SP2/0 細(xì)胞以muANP32B MAb 6C7（1∶500）為一抗；轉(zhuǎn)染pCAGGS-IBVYmPJ18-PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PA-His、pCAGGSIBVYmPJ18-NP-His 的293T 細(xì)胞分別以6×His-tag MAb（1∶500）作為一抗；轉(zhuǎn)染pCAGGS-muANP32B-flag 的DKO 細(xì)胞以flag MAb（1∶200）作為一抗。所有細(xì)胞培均以Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG（1∶200）作為二抗，室溫避光孵育1 h，DAPI 染核10 min 后，利用高分辨率活細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察IBV 感染宿主細(xì)胞后RdRp 各亞基及muANP32B 的定位情況。

2 結(jié) 果

2.1 IBV APN32（111-C）-RdRp 復(fù)合物的表達(dá)及純化將質(zhì)粒pCAGGS-IBVYmPJ18PB1、pCAGGS-IBVYmPJ18PB2、pCAGGS-IBVYmPJ18PA 和pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 共轉(zhuǎn)染DKO 細(xì)胞，將表達(dá)鼠和人ANP32B 蛋白的質(zhì)粒分別替換pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 作為兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組，36 h 后裂解細(xì)胞，離心后取上清，經(jīng)IP 試驗(yàn)純化后經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組[形成了（ANP32B（111-C）- RdRp（PB1-PB2-PA）復(fù)合物，簡(jiǎn)寫為ANP32B（111-C）-RdRp]和陽(yáng)性對(duì)照組經(jīng)IP 純化后均在約80 ku 處有單一目的條帶，分子量大小均與預(yù)期一致（圖1），表明鼠源muANP32B 羧基末端結(jié)構(gòu)域[muANP32B（111-C）-flag]確實(shí)能夠特異性結(jié)合RdRp，且獲得了純度較高的ANP32B（111-C）-RdRp 復(fù)合物，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 ANP32B（111-C）-RdRp表達(dá)及純化的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of the expression and purification of ANP32B(111-C)-RdRp by SDS-PAGE

2.2 MAb 的篩選與鑒定結(jié)果將IP 試驗(yàn)得到的ANP32B（111-C）-RdRp 復(fù)合物免疫BALB/c 雌性小鼠，并經(jīng)間接ELISA方法篩選。結(jié)果顯示，篩選出27株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。利用western blot鑒定MAb所靶向的蛋白，結(jié)果顯示，共獲得4 類MAb，即獲得了穩(wěn)定分泌PB1 亞基、PB2 亞基、PA 亞基、muANP32B（111-C）MAb的雜交瘤細(xì)胞各3株、2株、17株和5株。

2.3 MAb 效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果根據(jù)間接ELISA 和western blot 結(jié)果，在以上4類雜交瘤細(xì)胞株中分別取上清效價(jià)最高者，經(jīng)有限稀釋法3 次克隆純化并誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水，利用間接ELISA 方法檢測(cè)其效價(jià)。結(jié)果顯示，純化后獲得的PB1、PB2、PA、muANP32B（111-C）MAb 效價(jià)分別為1∶2.56×105（1D10）、1∶5.12×105（1E9）、1∶1.28×105（2E9）、1∶6.4×104（6C7）。以上數(shù)據(jù)表明本實(shí)驗(yàn)獲得的4 類MAb 的效價(jià)均較高。

2.4 MAb 交叉反應(yīng)性的鑒定結(jié)果獲得的靶向IBV RdRp 亞基PB1、PB2、PA 的MAb 分別與不同流感病毒（A、B、C、D 型）RdRp 各亞基蛋白反應(yīng)后經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示，本研究制備的IBV RdRp各單亞基MAb 均能夠與IBVVictoria株和IBVYamagata株RdRp對(duì)應(yīng)的單亞基蛋白（PB1、PB2、PA）結(jié)合，分別在83 ku、85 ku、81 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，但與A、C、D 型流感病毒RdRp 對(duì)應(yīng)單亞基均不結(jié)合，在相應(yīng)位置處無(wú)目的條帶（圖2A～圖2C）。本研究制備的muANP32B（111-C）MAb 對(duì)鼠、雞、牛、豬、犬的ANP32B 蛋白以及雞的ANP32A 蛋白識(shí)別能力較強(qiáng)，相應(yīng)條帶顏色較深，而與馬的ANP32 蛋白均不反應(yīng)。轉(zhuǎn)染pCAGGS-flag質(zhì)粒的陰性對(duì)照組無(wú)該條帶（圖2D～圖2E），表明本實(shí)驗(yàn)制備的IBV RdRp 亞基PB1、PB2、PA 的MAb 對(duì)各IBV 的識(shí)別特異性較強(qiáng)，且ANP32B（111-C）蛋白MAb的物種廣譜性較好。

圖2 MAb交叉反應(yīng)性的western blot鑒定結(jié)果Fig.2 Cross reactivity test results identified by western blot

2.5 利用MAb 對(duì)IBV 感染的MDCK 細(xì)胞及鼠源細(xì)胞中天然靶蛋白定位的激光共聚焦試驗(yàn)結(jié)果將IBV 分別接種至4 個(gè)細(xì)胞密度約為50%的MDCK 細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；同時(shí)以分別轉(zhuǎn)染表達(dá)IBV NP、PB1、PB2 及PA 蛋白的質(zhì)粒并培養(yǎng)24 h 的293T 細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。上述細(xì)胞分別加入相應(yīng)的一抗和二抗后，利用激光共聚焦試驗(yàn)分析制備的各MAb 與其各天然靶蛋白之間的反應(yīng)性并對(duì)后者進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，以IBV NP MAb 為一抗的MDCK 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染IBV NP 蛋白質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照293T 細(xì)胞均出現(xiàn)紅色熒光（圖3A～圖3B），表明MDCK 細(xì)胞已被IBV感染及293T 細(xì)胞中IBV NP 蛋白獲得了表達(dá)。在該前提下，分別孵育PB2 MAb 1D10、PB1 MAb 1E9、PA MAb 2E9 的MDCK 細(xì)胞均出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)，前者熒光信號(hào)在細(xì)胞核內(nèi)較強(qiáng)，后兩者在細(xì)胞質(zhì)中的熒光信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照組中，轉(zhuǎn)染表達(dá)IBV PB2 蛋白質(zhì)粒的細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光，且熒光集中在細(xì)胞核內(nèi)。同樣的，轉(zhuǎn)染表達(dá)PB1、PA 的293T 細(xì)胞均出現(xiàn)紅色熒光，且熒光信號(hào)集中在細(xì)胞質(zhì)中（圖3A～圖3B）；將SP2/0 細(xì)胞培養(yǎng)至密度約為50%，同時(shí)將CAGGS-muANP32B-flag 轉(zhuǎn)染至DKO 細(xì)胞中作為陽(yáng)性對(duì)照， 24 h 后分別孵育相應(yīng)抗體后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，SP2/0 細(xì)胞與陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞均出現(xiàn)紅色熒光，且熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)（圖3C～圖3D）。上述結(jié)果表明，本研究制備的分別靶向IBV RdRp 各單亞基的MAb，均能夠在感染IBV的MDCK 細(xì)胞中檢測(cè)到病毒表達(dá)的對(duì)應(yīng)天然靶蛋白。其中PB2 亞基主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，而PB1 和PA 亞基在胞質(zhì)中較多，胞核內(nèi)較少，且各亞基在MDCK 細(xì)胞內(nèi)的定位與對(duì)應(yīng)單亞基蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的各293T 細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組一致。本研究制備的MAb 6C7 能夠檢測(cè)SP2/0 細(xì)胞（鼠源細(xì)胞）內(nèi)源性的muANP32B 蛋白，其主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，與對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)muANP32B 質(zhì)粒的DKO 細(xì)胞陽(yáng)性對(duì)照組一致。本研究所制備的3 種針對(duì)RdRp 亞基的MAb 均能夠與其對(duì)應(yīng)天然靶蛋白結(jié)合，可用于指示IBV RdRp各亞基在病毒感染過(guò)程中在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

圖3 MAb與其靶蛋白亞細(xì)胞定位的激光共聚焦試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Subcellular co-localization of MAbs and their target proteins in vivo under confocal microscopy

3 討 論

IBV 常在全球范圍內(nèi)與IAV 共流行，在流感局部暴發(fā)或季節(jié)性流行中占比很高，嚴(yán)重威脅公眾健康[3,9]。近年來(lái)，IBV 在我國(guó)很多地方成為季節(jié)性流感的優(yōu)勢(shì)病毒，對(duì)兒童及青少年的致死率已經(jīng)高于IAV[10]。vRNP 作為流感病毒最小的復(fù)制單元，對(duì)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存發(fā)揮重要作用。大量研究表明，vRNP 中RdRp 的表觀遺傳學(xué)修飾及其與宿主蛋白的相互作用是維持其正常功能的必要條件[6-7]。同時(shí)，快速、高效的聚合酶表達(dá)純化技術(shù)是聚合酶功能分析的基礎(chǔ)，但由于其異源三聚體的復(fù)雜性，致使流感病毒聚合酶純化的各種工藝均存在一定缺陷。有研究人員通過(guò)在聚合酶PB2 亞基引入TAP 標(biāo)簽對(duì)其進(jìn)行純化。然而，單純的標(biāo)簽純化策略不但在一定程度上影響了聚合酶活性，也無(wú)法在純化產(chǎn)物中去除未組裝成復(fù)合物的PB2 單亞基[11-13]。本研究室前期采用在293T 細(xì)胞中表達(dá)IBV 聚合酶單亞基PB1-HA、PB2、PA-flag蛋白，并以雙標(biāo)簽2步法的策略對(duì)聚合酶復(fù)合物進(jìn)行純化，發(fā)現(xiàn)該方法雖然能夠去除多余的單亞基，但由于必須純化2 次導(dǎo)致目的蛋白產(chǎn)量很低，影響最終的純化效率。

研究表明，ANP32家族蛋白的ANP32A、ANP32B、ANP32E 可通過(guò)與流感病毒聚合酶的相互作用維持其在宿主細(xì)胞內(nèi)的正常功能。該類相互作用主要發(fā)生在ANP32 蛋白羧基末端的結(jié)構(gòu)域，且僅發(fā)生在ANP32 蛋白與流感病毒聚合酶復(fù)合物之間，而ANP32 蛋白與流感病毒聚合酶各單體之間不發(fā)生相互作用[14]。近期，張振宇等人的研究發(fā)現(xiàn)人ANP32A與IBV RdRp 的親和力高達(dá)0.05418 μmol/L[7]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)利用ANP32 蛋白與流感病毒RdRp 之間的高親和力，將muANP32B（111-C）-flag 作為誘餌蛋白，利用IP 技術(shù)富集RdRp，從而得到了純度較高的IBV ANP32-RdRp 復(fù)合物。該純化策略不但節(jié)約時(shí)間成本，所獲得的RdRp 各亞基均不含標(biāo)簽蛋白，也不影響聚合酶的空間結(jié)構(gòu)，相對(duì)提高了小鼠對(duì)聚合酶復(fù)合物的免疫應(yīng)答能力，將該復(fù)合物免疫小鼠并通過(guò)間接ELISA 方法篩選，一次性即獲得了多株可識(shí)別IBV RdRp 不同亞基的MAb，并通過(guò)激光共聚焦技術(shù)利用這些MAb 對(duì)IBV 感染MDCK 細(xì)胞后的RdRp 各亞基的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，所有MAb 均較好地檢測(cè)出RdRp 各亞基在受感染細(xì)胞中的定位情況，其中PB2 亞基主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，而PB1 和PA 亞基則在胞質(zhì)中較多，核內(nèi)較少，這可能與PB2 亞基單獨(dú)入核，而PB1 和PA亞基需要在胞質(zhì)內(nèi)形成二聚體后才能入核有關(guān)。

綜上所述，本研究建立了一種高效的IBV RdRp純化及其各單亞基MAb 的制備策略，并得到了IBV RdRp 單亞基PB1、PB2、PA 以鼠源ANP32B（111-C）的MAb，為該病毒RdRp 的相關(guān)研究及其應(yīng)用提供了有效的技術(shù)支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。