馬官芹，王 巖，林躍智，王曉鈞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）屬于CNC（Cap-ncollar）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是細(xì)胞重要的抗氧化因子。阻滯Nrf2 的激活則會加重機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，Nrf2 的激活依賴其負(fù)調(diào)控因子胞漿蛋白kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）。Nrf2 和Keap1 形成復(fù)合物以其非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，并通過Keap1 介導(dǎo)的泛素化持續(xù)降解Nrf2，以保持生理狀態(tài)下Nrf2 的低水平狀態(tài)[1]。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時，機(jī)體會通過多種方式誘導(dǎo)或促進(jìn)Nrf2 和Keap1 的解離，導(dǎo)致Keap1 對Nrf2 的泛素化減弱，Nrf2 蛋白則會發(fā)生細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的移位和磷酸化，啟動下游抗氧化反應(yīng)元件（ARE）靶基因的表達(dá)，調(diào)控Ⅱ相代謝酶（GST、NQO1 等）、抗氧化酶（SOD、HO-1 過氧化物酶-1 等）的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮其抗氧化損傷作用[2]。

宿主細(xì)胞Keap1-Nrf2-ARE 通路不僅在病毒感染中起重要作用，其調(diào)控病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制的機(jī)制也很復(fù)雜[3]。病毒對該通路具有雙向調(diào)控作用：一方面病毒要利用感染造成的氧化應(yīng)激環(huán)境復(fù)制，因此要抑制Nrf2-ARE 抗氧化通路的激活。如呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）可通過蛋白酶體途徑誘導(dǎo)Nrf2 的去乙酰化和泛素化[4]，牛皰疹病毒1 型（Bovine herpesvirus 1，BoHV-1）可促進(jìn)Nrf2 的降解和抑制Nrf2 的乙酰化，從而抑制Nrf2 的激活[5]；另一方面持續(xù)性的氧化應(yīng)激會致宿主細(xì)胞的損傷，已證實(shí)有多種病毒需要通過激活Nrf2-ARE 通路來調(diào)控氧化與抗氧化的平衡。如人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiencyvirus，HIV-1）通過gp120 和Tat誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Nrf2-ARE 的激活[6]，乙型肝炎病毒（Hepatitis B，HBV）也可通過編碼HBx 和膜蛋白LHB 激活該通路[7]?？傊《疽蜒莼龆喾N調(diào)控Nrf2-ARE 通路的途徑和方式來“綁架”宿主的抗氧化進(jìn)程，以便利于自身的復(fù)制。

近年來，CRISPR/Cas9 技術(shù)由于具有操作簡便，實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢在基因組編輯以及治療癌癥、感染和遺傳疾病方面顯示出巨大潛力。Cas9 和sgRNA是CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基因組編輯的重要組成部分：sgRNA 負(fù)責(zé)定位，Cas9 參與靶位點(diǎn)DNA 的切割。靶位點(diǎn)的識別需要前間隔序列鄰近基序（PAM），因此任何含有NGG 基序的DNA 序列均可被識別為靶位點(diǎn)，從而可快速實(shí)現(xiàn)對靶基因的敲除、敲入及修飾等?；诖?，本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建Nrf2基因敲除的HEK293T 細(xì)胞系，利用該細(xì)胞初步研究了Nrf2 對EIAV 的抗病毒效果，為進(jìn)一步研究和闡明Nrf2 調(diào)控病毒復(fù)制的機(jī)制研究提供有效工具。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料人胚胎腎細(xì)胞（HEK293T）由本實(shí)驗(yàn)室購買并保存；EIAV 假病毒包裝質(zhì)粒（VSVG、Pony8.1、UKgp）、EIAV 感染性克?。–MV3-8）、pVR1012-flag-Nrf2 表達(dá)載體均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；ExTaqDNA 聚合酶購自Toyobo 公司；限制性內(nèi)切酶BsmB I 購自Thermo Fisher Scientific 公司；Lenti-CRISPRv2-GFP 載體購自Addgene 公司；RNA 提取試劑盒購自Bio Flux 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、DNA 小提試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；CCK-8 細(xì)胞活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液、5×蛋白上樣緩沖液由本實(shí)驗(yàn)室制備；蛋白Marker 購自Thermo Fisher Scientific 公司；DNA 轉(zhuǎn)染試劑PolyjetTM購自Sigma Gen Laboratories 公司；Pen Strep（雙抗）購自Gibco 公司；鼠源Nrf2 單克隆抗體（MAb）、EIAV 核蛋白（p26）MAb 由本實(shí)驗(yàn)室制備并純化；兔源Flag標(biāo)簽抗體、兔源actin 標(biāo)簽抗體、鼠源actin 標(biāo)簽抗體、紅外熒光標(biāo)記羊抗兔IgG（IgG-Dylight700）、紅外熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG（IgG-Dylight800）、Reverse Transcriptase Assay 試劑均購自Sigma 公司；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司。實(shí)驗(yàn)中所涉及的引物和測序均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 sgRNA 的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 登錄的Nrf2 基因序列（S74017.1），利用張鋒實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站（http://crispr.mit.edu/）靶向Nrf2 基因設(shè)計(jì)特異性sgRNA，依照sgRNA 的設(shè)計(jì)原則，選擇評分較高的2 組序列作為sgRNA（圖1）。

圖1 Nrf2基因敲除sgRNA的設(shè)計(jì)Fig.1 Design strategy of sgRNA for Nrf2 knockout

1.3 LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定利用設(shè)計(jì)的特異性sgRNA（表1），通過程序性退火將兩對sgRNA 分別合成雙鏈DNA（98 ℃30 min，95 ℃5 min）后，利用T4 連接酶將該雙鏈DNA 在室溫連接至經(jīng)BsmB I 線性化的載體LentiCRISPRv2-GFP 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN1 和LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2，并分別經(jīng)測序鑒定后用于敲除細(xì)胞系的構(gòu)建。

表1 靶向Nrf2基因的sgRNA序列Table 1 The sequence of sgRNA targeting Nrf2 gene

1.4 不同sgRNA 沉默Nrf2 基因效率的檢測將生長狀態(tài)良好的HEK293T 細(xì)胞鋪至6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，分4 個組利用PolyjetTM轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒：pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP（陰性對照）、pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN1、pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN2 和pVR1012-flag-Nrf2+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAN1+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2。轉(zhuǎn)染24 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗后，每孔加入200 μL 細(xì)胞裂解液，10 min 后12 000 r/min 離心5 min，取120 μL 上清加入30 μL 預(yù)熱的5×loading buffer，98 ℃10 min 后經(jīng)SDS-PAGE 后。分別以兔源Flag 抗體（1∶5 000）和兔源actin 抗體（1∶10 000）作為一抗，以紅外熒光標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶10 000）作為二抗經(jīng)western blot 檢測，并利用Image Studio 軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，篩選出沉默Nrf2 基因效率最高的sgRNA。

1.5 Nrf2 基因敲除的HEK293T 細(xì)胞系的制備、篩選及鑒定將生長狀態(tài)良好的HEK293T 細(xì)胞鋪至6孔板內(nèi)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，利用PolyjetTM試劑轉(zhuǎn)染沉默Nrf2 基因效率最高的LentiCRISPRv2-GFPsgRNA-N1 質(zhì)粒2 μg，24 h 后收獲細(xì)胞，利用超速流式分選系統(tǒng)分選出表達(dá)GFP 的單一細(xì)胞于96 孔板中培養(yǎng)10 d 左右，在顯微鏡下挑選由單個細(xì)胞長成的細(xì)胞集落，將其轉(zhuǎn)移至6 孔板內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)。待6 孔板中細(xì)胞密度約為80%時，收集細(xì)胞，一部分加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白（同1.4）后分別利用鼠源Nrf2 MAb（1∶2 000）和兔源actin 抗體（1∶10 000）作為一抗，紅外熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶10 000）、紅外熒光標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶10 000）作為二抗經(jīng)western blot 檢測蛋白敲除情況，利用近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（Odyssey CLX）結(jié)合Image Studio 軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

采用TRIzol 法提取另一部分細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，依據(jù)sgRNA 所對應(yīng)的Nrf2 基因序列位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物（5′-ATGCAGCCAGATCCCAGGCCTA GCGGGGCT- 3′/5′- ACAGGTACAGTTCTGCTGGTCAAT CTGCTT-3′）經(jīng)PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定。

1.6 敲除Nrf2 基因后細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性檢測將經(jīng)上述方法鑒定為Nrf2 基因敲除的單克隆細(xì)胞株（HEK293T-Nrf2KO）傳代培養(yǎng)至第10 代（G10）、15 代（G15）、20 代（G20）時分別收取細(xì)胞，采用1.5 中的western blot 方法鑒定Nrf2 的表達(dá)；按照1×104個/孔分別將HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞鋪至96 孔板內(nèi)，設(shè)置3 個復(fù)孔，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，混勻后37 ℃培養(yǎng)1 h，使用酶標(biāo)儀讀取OD450nm處的吸光值，分析Nrf2 敲除后對細(xì)胞活力是否產(chǎn)生影響。

1.7 敲除Nrf2 基因?qū)IAV 復(fù)制影響的檢測將生長狀態(tài)良好的HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞鋪至6 孔板，參照1.5 的方法分別將EIAV 的感染性克隆CMV3-8及Nrf2 基因回補(bǔ)的感染性克隆（CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2）轉(zhuǎn)染至HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞中，設(shè)CMV3-8轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞作為對照。轉(zhuǎn)染24 h后收獲上清和細(xì)胞，分別利用鼠源Nrf2 MAb（1∶2 000）、EIAV 核蛋白（p26）抗體（1∶5 000）、兔源actin 抗體（1∶10 000）以及兔源Flag 抗體（1∶5 000）作為一抗，分別以紅外熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000）、紅外熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶10 000）作為二抗對上清和細(xì)胞中的病毒蛋白經(jīng)western blot 檢測，并對蛋白表達(dá)結(jié)果經(jīng)灰度分析EIAV 的復(fù)制情況。

1.8 敲除Nrf2 基因后細(xì)胞上清中病毒的反轉(zhuǎn)錄酶試驗(yàn)（Reverse transcriptase assay，RT）將1.7 中收獲的細(xì)胞上清各取100 μL 原液、10 倍、20 倍和40 倍稀釋液分別與50 μL PEG 8000 混勻，冰浴8 h 后4 ℃，8 000 r/min 離心10 min，棄上清，用40 μL 病毒裂解緩沖液重懸，室溫孵育30 min。按照表2 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（試劑盒中附帶），在重懸的病毒團(tuán)塊和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品中分別加入20 μL 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液（試劑盒中附帶），37 ℃孵育1 h。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的樣品加入MP 孔（試劑盒中附帶）中，另設(shè)置60 μL PBS 對照，37 ℃孵育1 h。棄去反應(yīng)液，用wash buffer 洗滌3 次，每孔加入200 μL地高辛過氧化物酶抗體，37 ℃孵育1 h。棄去反應(yīng)液，用wash buffer 洗滌3 次，每孔加入200 μL 顯色底物，室溫孵育5 min～10 min，至出現(xiàn)肉眼可見的綠色。讀取OD405nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品值，以分析培養(yǎng)液上清中病毒粒子的含量。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋Table 2 Standard diluent

1.9 EIAV 假病毒感染敲除Nrf2 的細(xì)胞后病毒復(fù)制水平的檢測將包裝EIAV 假病毒所需要的質(zhì)粒UKgp、Pony8.1、VSV-G 按照3∶3∶1 的比例共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，48 h 收獲含有病毒的上清液。將生長狀態(tài)良好的HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞分別鋪至24 孔板內(nèi)，設(shè)置3 個復(fù)孔，待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時，加入100 μL 假病毒上清液，24 h 后棄去上清，每孔加100 μL 細(xì)胞裂解液，利用微孔板化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測病毒液螢火蟲熒光素酶的活性值，分析EIAV 假病毒在細(xì)胞中的復(fù)制水平。

2 結(jié) 果

2.1 LentiCRISPRv2-sgRNA 基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果將sgRNA-N1 和sgRNA-N2 分別退火獲得雙鏈DNA，克隆至LentiCRISPRv2-GFP載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1 和LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2，經(jīng)測序分析結(jié)果顯示，可檢測到正確的sgRNA序列，表明重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

2.2 不同sgRNA 沉默Nrf2 基因效率的檢測結(jié)果將構(gòu)建的兩個LentiCRISPRv2-GFP-sgRNAs 分別與表達(dá)Nrf2 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，western blot 檢測Nrf2 的表達(dá)并進(jìn)行蛋白灰度值分析。結(jié)果顯示，與對照組相比，LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1 和LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2 以及LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1+LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N2 均能顯著下調(diào)Nrf2 的表達(dá)（P＜0.01）（圖2A、圖2B），表明設(shè)計(jì)的sgRNA均具有較高的沉默效率，本研究選擇LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 sgRNA敲除Nrf2基因的western blot檢測（A）和灰度值分析（B）Fig.2 Western blot detection(A)and gray value analysis(B)of sgRNA knockout Nrf2 gene

2.3 Nrf2 基因敲除的HEK293T 細(xì)胞系的構(gòu)建與篩選將LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1 轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀和有限稀釋法篩選表達(dá)GFP的單細(xì)胞克隆。經(jīng)過10 d 培養(yǎng)，將單克隆細(xì)胞長成的細(xì)胞集落經(jīng)western blot 鑒定。結(jié)果顯示，N2 和N4 2 株單細(xì)胞克隆株未檢測到Nrf2 的內(nèi)源性表達(dá)（圖3A）。隨后提取2 株細(xì)胞總RNA，PCR 擴(kuò)增后測序鑒定，結(jié)果顯示，Nrf2基因敲除的細(xì)胞基因組缺失一個堿基T，導(dǎo)致Nrf2 基因發(fā)生移碼突變無法表達(dá)（圖3B）。表明獲得了Nrf2基因敲除的HEK293T 細(xì)胞。

圖3 HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞中Nrf2基因表達(dá)的western blot（A）和測序（B）鑒定結(jié)果Fig.3 Western blot(A)and sequencing(B)identification of Nrf2 gene expression in HEK293T-Nrf2KO cells

2.4 敲除Nrf2 基因后細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性檢測結(jié)果將獲得的HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞傳代，并隨機(jī)選取G10、G15、G20 代次的細(xì)胞經(jīng)western blot 檢測Nrf2的表達(dá)。結(jié)果顯示，3 個代次細(xì)胞中均未檢測到內(nèi)源性Nrf2 的表達(dá)（圖4A、圖4B）。利用CCK-8 試劑盒檢測HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示，該細(xì)胞與HEK293T 具有相似的生長活性，即Nrf2 基因的敲除未對細(xì)胞活性產(chǎn)生影響（圖4C）。以上結(jié)果表明獲得了Nrf2 基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系。

圖4 Nrf2基因敲除細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性的western blot（A）及其灰度值分析（B）和CCK-8法檢測細(xì)胞的活性（C）Fig.4 Genetic stability of Nrf2 knockout cell lines by western blot(A)and its gray value analysis(B)and CCK-8 assay for cell activity(C)

2.5 敲除Nrf2 基因?qū)IAV 增殖影響的檢測結(jié)果為了研究所獲得的Nrf2 敲除細(xì)胞系是否影響EIAV的復(fù)制，將EIAV 的感染性克隆CMV3-8及Nrf2 基因回補(bǔ)的感染性克隆（CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2）分別轉(zhuǎn)染至HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞中，并設(shè)置轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T 細(xì)胞作為對照。通過western blot 檢測各組細(xì)胞中病毒蛋白Gag（剪切體為p55、p26，p26 可分泌至細(xì)胞外）和上清中病毒蛋白（p26）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T 細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞與上清中病毒蛋白Gag 的表達(dá)量均上調(diào)約1.5 倍，而轉(zhuǎn)染CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2 的HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞與上清中病毒蛋白Gag 的表達(dá)量均下調(diào)約50%（圖5A、圖5B），可見敲除Nrf2 基因促進(jìn)了細(xì)胞和上清中Gag 蛋白的表達(dá)（本實(shí)驗(yàn)室制備的p26抗體可同時檢測到Gag兩個剪切體p55、p26）。表明Nrf2 基因可以抑制EIAV 在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)。

圖5 敲除Nrf2對EIAV增殖影響的western blot檢測結(jié)果（A）及其灰度值分析（B）Fig.5 Detection results of the effect of Nrf2 knockout on EIAV proliferation(A)and analysis of its grayscale values(B)

2.6 敲除Nrf2 基因后細(xì)胞上清中病毒的RT 結(jié)果將收獲的上述各組細(xì)胞上清各取原液及不同倍數(shù)的稀釋液分別與50 μL PEG8000 混勻、離心、裂解后，利用RT檢測其中病毒反轉(zhuǎn)錄酶的含量，以分析各組培養(yǎng)液上清中病毒粒子的含量。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染CMV3-8的HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞上清中病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的含量上調(diào)約1.5倍，而轉(zhuǎn)染CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2 的HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞上清中的病毒逆轉(zhuǎn)錄酶含量下調(diào)約50%（圖6）。再次證明Nrf2 基因具有抑制EIAV 復(fù)制的作用。

圖6 敲除Nrf2基因后細(xì)胞中病毒復(fù)制能力的檢測結(jié)果Fig.6 Detection of viral replication capacity in cells after knockout of Nrf2

2.7 EIAV假病毒感染Nrf2基因敲除細(xì)胞后的病毒復(fù)制水平的檢測結(jié)果為進(jìn)一步探究Nrf2 調(diào)控EIAV 復(fù)制的分子機(jī)制，本研究利用重組質(zhì)粒UKgp、Pony8.1、VSV-G 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞制備EIAV 假病毒，將其分別感染HEK293T 和HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞，24 h 后裂解細(xì)胞通過檢測螢火蟲熒光素酶的活性，評價該假病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平。結(jié)果顯示，假病毒感染的HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞上清中熒光素酶的活性與其轉(zhuǎn)染的HEK293T 細(xì)胞相比上調(diào)約2.5 倍（P＜0.01）（圖7），進(jìn)一步表明Nrf2 抑制了EIAV 在HEK293T 細(xì)胞中的復(fù)制。

圖7 EIAV假病毒感染敲除Nrf2細(xì)胞后的病毒復(fù)制水平檢測結(jié)果Fig.7 Detection of viral replication levels after Nrf2 knockout cells infection with EIAV pseudovirus

3 討 論

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用最廣泛，且具有設(shè)計(jì)簡單、易于使用和多路復(fù)用（能夠同時編輯多個基因）的優(yōu)點(diǎn)，同時，它還能夠有效地修飾各物種和不同細(xì)胞類型的內(nèi)源性基因[8-9]。另外，帶有轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活因子的改良CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄抑制或激活靶基因[10]。但在長期的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9 技術(shù)經(jīng)常發(fā)生脫靶的問題[11]，所以本研究在進(jìn)行CRISPR/Cas9 試驗(yàn)時，利用NCBI 檢索了Nrf2 全基因，之后利用張峰實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站靶向Nrf2第一和第二外顯子分別設(shè)計(jì)了sgRNA。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的兩條sgRNA的切割效率均高效。

Nrf2-ARE 作為宿主抗氧化防御的核心途徑，在調(diào)控宿主的抗氧化損傷過程中發(fā)揮重要作用，并參與腫瘤、凋亡、自噬和炎癥等多種病理過程的調(diào)控。目前，主要研究的是Nrf2的抗病毒功能，而對其抗病毒機(jī)制研究的較少。本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了2 條靶向Nrf2 的sgRNAs，將sgRNAs 插入LentiCRISPRv2-GFP 載體，獲得Nrf2 基因敲除的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，通過流式篩選和無限稀釋的方法獲得Nrf2 基因敲除的HEK293T 細(xì)胞系HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞，通過多次傳代并鑒定后確定該細(xì)胞系可穩(wěn)定遺傳。本研究將EIAV 的感染性克隆CMV3-8，及EIAV 的假病毒分別感染該細(xì)胞系，通過western blot、RT及熒光素酶活性檢測表明Nrf2蛋白能夠抑制EIAV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

Nrf2-ARE 是宿主細(xì)胞抗氧化防御體系的第一道防線，是其對抗病毒感染引起氧化應(yīng)激最重要的防御系統(tǒng)。許多具有抗氧化防御功能的蛋白質(zhì)，都依賴于Nrf2 通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Nrf2-ARE 通路對宿主細(xì)胞氧化還原平衡的維持、氧化應(yīng)激致細(xì)胞損傷的預(yù)防及炎癥平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制是復(fù)雜多樣的。而機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化這一平衡的移動方向直接關(guān)系到病毒所致疾病的發(fā)展方向。因此，對病毒和宿主Nrf2 通路調(diào)控機(jī)制的深入認(rèn)知，明確如何調(diào)控抗氧化途徑治療病毒性疾病，成為氧化應(yīng)激相關(guān)疾?。ú《拘约膊?、癌癥、心血管系統(tǒng)疾病和炎癥等）預(yù)防和治療的熱點(diǎn)。本研究團(tuán)隊(duì)還利用該細(xì)胞系檢測了敲除Nrf2 基因?qū)︸R流感病毒復(fù)制的影響，獲得的結(jié)果與本研究結(jié)果一致（數(shù)據(jù)未顯示），推測Nrf2 對病毒在細(xì)胞中復(fù)制的抑制作用可能具有普遍性。本研究構(gòu)建的HEK293T-Nrf2KO細(xì)胞系可為Nrf2 基因的抗病毒機(jī)制研究提供重要的技術(shù)平臺，也可為Nrf2-ARE 通路調(diào)控病毒機(jī)制的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。