高金偉，田 興，謝 敏，李紹明，袁希平，鄧時銘，宋 銳

（湖南省水產(chǎn)科學研究所，湖南 長沙 410153）

中華倒刺鲃（Spinibarbus sinensis），隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鲃亞科（Barbinae）、倒刺鲃屬（Spinibarbus），俗稱青波、巖鯽、烏鱗等，是我國長江流域特有的大型名貴經(jīng)濟魚類。中華倒刺鲃以肉質(zhì)細嫩、鮮腴肥美、營養(yǎng)豐富而著稱，具有個體大、食譜廣、生長快、適溫范圍廣、易馴養(yǎng)、抗病力強等特點，適宜于池塘、水庫和規(guī)?；B(yǎng)殖，備受消費者和水產(chǎn)養(yǎng)殖者的青睞，已成為我國淡水水域的重要養(yǎng)殖品種之一[1]。近年來，由于極大的市場需求和良好的經(jīng)濟前景的刺激，中華倒刺鲃的養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度不斷提高，加之養(yǎng)殖環(huán)境惡化、管理操作不當、種質(zhì)退化等原因，導致中華倒刺鲃的抗病力下降，病害的暴發(fā)日益嚴重，嚴重制約了中華倒刺鲃養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展壯大。目前，中華倒刺鲃的疾病有細菌性疾病、真菌性疾病、寄生蟲性疾病等，其中細菌性疾病是危害最為嚴重、影響最為廣泛的一類疾病，極大地影響了中華倒刺鲃的養(yǎng)殖效益。前期的研究報道了中華倒刺鲃肌肉潰爛病、細菌性爛鰓病、細菌性腸炎病、出血病等細菌性疾病[2-3]，其中中華倒刺鲃肌肉潰爛病的病原為伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderid）中的洋蔥霍爾德氏菌（Burkhol cepacid），而其余3 種細菌性疾病的病原仍未明確。此外，袁旦一等報道了一例維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）混合感染導致的中華倒刺鲃持續(xù)性死亡的病例[4]。朱成科等報道了患病中華倒刺鲃的致病菌為遲緩愛德華菌（Edwadsiella tarda）[5]。目前，國內(nèi)外僅有少數(shù)關于中華倒刺鲃致病菌的研究報道[2-5]，而關于池塘養(yǎng)殖的中華倒刺鲃致病性嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）的分離鑒定尚未見報道。

2019 年6 月湖南省長沙市某水產(chǎn)養(yǎng)殖基地池塘套養(yǎng)的中華倒刺鲃大量死亡，其他混養(yǎng)品種（草魚、鰱、鳙）未見死亡，病魚的臨床癥狀主要為體表出血，鱗片少量脫落，肛門脫垂紅腫，剖檢見淡黃色至淡紅色腹水，脾、腎腫大，鰾上有出血點，腸道無內(nèi)容物。通過鏡檢排除真菌及寄生蟲感染。本研究對患病的中華倒刺鲃進行了病原菌分離鑒定，進而檢測其攜帶的毒力基因和耐藥性，旨在分析該菌的分類地位、致病力并篩選防治藥物，以期為深入研究中華倒刺鲃病原多樣性、嗜水氣單胞菌的致病機理、傳播途徑及流行病學提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料瀕死中華倒刺鲃采自湖南省長沙市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體質(zhì)量（327.2±29.7）g，體長（28.6±1.83）cm。健康中華倒刺鲃取自湖南省水產(chǎn)科學研究所長沙基地，體質(zhì)量（300±25.1）g，體長（25.2±3.28），暫養(yǎng)于長（320 cm）×寬（155 cm）×高（80 cm）的水泥池中，水溫（28±1）℃，24 h 連續(xù)增氧，暫養(yǎng)1 周后用于人工感染試驗。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、氣單胞菌培養(yǎng)基（RS）、營養(yǎng)瓊脂（NA）、MH 瓊脂（MHA）、LB 瓊脂和哥倫比亞血瓊脂平板購自北京陸橋技術股份有限公司；革蘭氏染色液、藥敏紙片和生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；ExTaq?試劑盒和DL2000 Marker 購自寶生物技術（北京）有限公司；Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒和瓊脂粉購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 細菌的分離與純化在無菌條件下用接種環(huán)從患病中華倒刺鲃肝胰臟、脾臟和腎臟的新鮮斷面及腹水中取樣劃線，接種于TSA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)18 h后挑取單菌落接種于TSB 培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)18 h 后，于TSA 培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的菌株。共獲得4 株形態(tài)、大小基本一致的單克隆菌，依次編號為AH32～AH35，4 ℃保存?zhèn)溆?。選取AH32 進行后續(xù)試驗。

1.3 細菌形態(tài)特征觀察和生化鑒定取純培養(yǎng)菌AH32 經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)。將該菌株接種于RS、NA、LB、哥倫比亞血瓊脂等平板上，置于28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌株生長情況。將該菌株無菌接種于細菌微量生化反應管中，測定其生理生化特性。

1.4 細菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建提取分離菌株基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?6S rRNA基因序列的PCR 擴增引物及體系參照梁利國等的方法進行[6]。PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。利用SeqMan 軟件進行分離菌株16S rRNA 基因序列拼接。利用NCBI 的BLASTn 檢索系統(tǒng)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析16S rRNA 基因序列的同源性，并利用ClusterX 1.83 軟件對14 株同源性較高的16S rRNA 基因序列進行多重比對，再利用MEGA7 軟件包中Neighbour-Joining 法構建其系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 分離菌的多位點序列分型參照文獻合成gyrB、groL、gltA、metG、ppsA和recA6 個管家基因的擴增引物[7]，并將分離菌DNA 作為模板分別PCR 擴增6個管家基因，PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測得的管家基因序列利用SeqMan軟件拼接，并在線上傳至https://pubmlst.org/aeromonas/數(shù)據(jù)庫中進行分析，得到每個管家基因的等位基因號，按照gyrB-groL-gltA-metG-ppsA-recA的順序?qū)⒌任换蛱柵帕锌傻玫皆摲蛛x菌的序列型（Sequence type，ST），即多位點序列型。

1.6 分離菌毒力基因檢測選取氣單胞菌屬（Aeromonas）中6種常見毒力基因進行PCR擴增（表1），包括氣溶素（aer）、熱不穩(wěn)定腸毒素（alt）、黏附素（aha）、彈性蛋白酶（ela）、脂肪酶（lip）和蛋白酶（ahp），PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應參數(shù)為：95 ℃5 min；94 ℃45 s、退火30 s（退火溫度見表1）、72 ℃1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃10 min。

表1 嗜水氣單胞菌毒力因子的檢測引物Table 1 Primers of the virulence genes in Aeromonas hydrophila

1.7 藥物敏感試驗采用K-B 紙片擴散法對菌株AH32 進行30 種常用抗生素的耐藥性檢測。以涂布法接種0.1 mL濃度為1×108cfu/mL（約0.5個麥氏濁度）的AH32 菌液于MH 瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察并記錄抑菌圈的直徑（包括藥敏片），參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）發(fā)布的抗微生物藥物敏感性試驗指南和中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準-抗菌藥物敏感性試驗技術要求（WS/T 639-2018），以抑菌圈直徑大小作為分離菌株對藥物敏感性的判定依據(jù)。將分離菌AH32 對每種抗生素的耐藥情況用S、I、R 記錄，計算該菌的多重耐藥指數(shù)（Multi-antibiotic resistance indexes，MARIs）。

1.8 動物回歸感染試驗挑取AH32 單克隆于LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)（28 ℃，180 r/min），離心，棄上清，用0.9%的無菌生理鹽水洗滌2次，制成菌懸液，采用紫外分光光度計法（OD600nm）測定菌懸液的濃度，將菌懸液分別10倍倍比稀釋至1×109cfu/mL～1×105cfu/mL。將中華倒刺鲃隨機分成18 組，每組10 尾魚，5 個不同稀釋度的菌液隨機選取3 組腹腔注射0.1 mL 菌懸液，設為感染組；剩余3 組魚腹腔注射0.1 mL 無菌生理鹽水，設為對照組。連續(xù)7 d 記錄并觀察實驗魚的發(fā)病和死亡情況，同時從瀕死的中華倒刺鲃的內(nèi)臟器官進行病原菌的重分離，以引起人工感染的中華倒刺鲃發(fā)病死亡并能重新分離到相同的病原菌作為分離菌致病性的判定依據(jù)。

2 結果與討論

2.1 分離菌形態(tài)特征和理化特性分析患病魚的病料樣品接種TSA 培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h 后形成邊緣濕潤、表面光滑、中央微凸起、直徑約2 mm、灰白色或淡黃色的圓形菌落。分離菌在NA 和LB 瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征與在TSA 瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)基本一致，在RS 培養(yǎng)基上呈橙黃色。在哥倫比亞血瓊脂平板（含5%脫脂綿羊血）上生長良好，產(chǎn)生β-溶血圈。AH32 株為革蘭氏陰性短桿菌，能夠利用葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽、七葉苷等，不能利用乳糖、蜜二糖、尿素等；分解賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶。

2.2 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析PCR擴增AH32株的16SrRNA片段長度為1368bp（MW440455）。將其通過EZBio Cloud 數(shù)據(jù)庫進行序列同源性分析，結果與嗜水氣單胞菌16S rRNA 基因序列同源性高達99.78%；進化樹結果顯示，菌株AH32 與嗜水氣單胞菌（NR_043638、NR_074841、NR_113342）聚為一支（圖1）。

圖1 分離菌AH32 16S rRNA基因發(fā)育的系統(tǒng)進化樹Fig.1 The phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence of AH32

綜合分離菌株的表型特征、理化特性及16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結果，判定分離菌AH32 為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌。

2.3 多位點序列分型與毒力基因檢測結果分離株AH32 管家基因的PCR 結果顯示，獲得與6 個管家基因片段大小對應的單一亮條帶（圖2A），對PCR 產(chǎn)物序列在線比對，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌AH32 的等位基因圖譜為210-214-122-211-221-217，其序列型為ST251。菌株AH32 可檢測到alt、aha、ela、lip和ahp毒力基因（圖2B），檢出率為83.3%，其毒力基因型為alt+aer-aha+ahp+lip+ela+。上述結果表明，嗜水氣單胞菌AH32 攜帶多個與致病相關的毒力基因，且屬于高致病性序列型ST251。

圖2 分離株AH32的管家基因（A）和毒力基因（B）PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of housekeeping genes(A)and virulence genes(B)of isolated strain AH32

研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌ST251 型是引起中國和美國養(yǎng)殖魚類細菌性敗血癥的高風險序列型，能夠?qū)Φ~類的養(yǎng)殖造成嚴重的經(jīng)濟損失[8]。在中國，ST251 型菌株已成為江蘇、湖南、湖北、廣東等省份的主要流行菌株，其感染宿主主要為鯉科魚類[8-9]。本研究中， ST251 型嗜水氣單胞菌致中華倒刺鲃的大量死亡，再次說明ST251 型嗜水氣單胞菌在湖南地區(qū)池塘養(yǎng)殖的鯉科魚類中廣泛傳播。

致病菌表達和分泌毒力因子，進而侵入、定植和損傷宿主，檢測致病菌的毒力基因是評估其潛在致病性的重要手段。本研究中，嗜水氣單胞菌AH32 攜帶毒力基因aha、alt、ahp、lip和ela，未攜帶毒力基因aer，表明嗜水氣單胞菌AH32 對中華倒刺鲃產(chǎn)生的致病性可能與其分泌的外毒素密切相關，至于其致病機理與外毒素的相關性有待進一步探究。黃沙鱉源嗜水氣單胞菌的Alt和ahal基因與Aer、ahp等毒力基因之間存在協(xié)同作用，且毒力基因型為hly+Aer-Alt+Act+ahal-ahp+的嗜水氣單胞菌致病力顯著低于hly+Aer+Alt+Act+ahal-ahp+的菌株[10]。劉小芳等指出，魚源嗜水氣單胞菌的alt、aer、lip等毒力基因與嗜水氣單胞菌的致病力呈正相關，且是否攜帶aer基因不作為氣單胞菌致病力強弱的判定依據(jù)[11]。由此表明，嗜水氣單胞菌毒力的強弱依賴于其毒力因子的合成與分泌，其毒力的發(fā)揮是多種毒力基因協(xié)同作用的結果，且與其攜帶毒力基因的種類、數(shù)量以及毒力基因的表達情況密切相關。

2.4 藥敏試驗結果分離菌AH32 對頭孢他啶、頭孢曲松、多西環(huán)素等19 種抗生素敏感，對鏈霉素、紅霉素、美羅培南中度敏感，對氨芐西林、頭孢拉定、克林霉素等8 種抗生素耐藥。分離菌AH32 的MARIs 為0.33。以上結果表明，分離菌AH32 對所選用的抗生素具有一定的耐藥性。

目前，抗菌藥物依然是水產(chǎn)動物疾病控制的主要手段之一，但由于抗菌藥物的不合理使用、耐藥菌株的傳播及耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，導致水產(chǎn)動物致病菌的耐藥性問題日益突出。本研究中，分離株AH32 對第一代頭孢類抗生素頭孢拉定高度耐藥，對頭孢曲松、頭孢吡肟等第三代和第四代頭孢類抗生素高度敏感，這與蔡麗娟等在草魚、鯽、團頭魴等魚源嗜氣單胞菌的藥敏結果一致[12]，而與鱘源嗜水氣單胞菌對上述頭孢類藥物均高度耐藥的研究結果不一致[13]，表明嗜水氣單胞菌不同分離株對抗菌藥物的耐藥性存在差異，這可能與養(yǎng)殖品種、養(yǎng)殖環(huán)境、用藥習慣、給藥途徑等因素密切相關。目前，藥敏試驗仍然是篩選敏感性高、療效確定抗菌藥的重要手段。本研究中，嗜水氣單胞菌AH32 對氟苯尼考、恩諾沙星、左氧氟沙星等19 種抗菌藥物敏感。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020 年2 號》文件中指出，氟苯尼考、恩諾沙星和多西環(huán)素為已批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥，因此在中華倒刺鲃養(yǎng)殖過程中，可選用這3 種藥物防治。

2.5 人工感染試驗結果將健康中華倒刺鲃經(jīng)腹腔注射分離菌株AH32 后，接種不同濃度菌液后出現(xiàn)不同程度的死亡，且隨著菌懸液濃度的增加，其死亡率呈上升趨勢；對照組中華倒刺鲃在試驗期間未出現(xiàn)死亡。接種24 h 后，1×109cfu/mL 濃度組的實驗魚開始出現(xiàn)死亡，胸鰭基部明顯出血，肛門紅腫，癥狀與自然發(fā)病的中華倒刺鲃臨床癥狀一致。從感染死亡的魚體肝臟、腎臟及腹水中再次分離純化到感染菌，經(jīng)細菌學特征鑒定，其性狀與原菌株AH32 一致。結果表明，嗜水氣單胞菌AH32 是該次中華倒刺鲃死亡的致病菌。

嗜水氣單胞菌屬于弧菌科（Vibrionaceae）、氣單胞菌屬，普遍存在于土壤、養(yǎng)殖水體和水生動物腸道中，是典型的人-獸-魚共患條件致病菌。近年來，先后從青魚（Mylopharyngod piceus）[6]、異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）[7]等不同的鯉科魚類體內(nèi)分離鑒定出嗜水氣單胞菌，本研究首次從患病中華倒刺鲃體內(nèi)分離獲得嗜水氣單胞菌，表明嗜水氣單胞菌對水生動物宿主的廣泛適應性及其宿主范圍的進一步擴大。