李 茵，潘玉迪，田 進(jìn)，曲連東

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

干擾素（IFN）是一種由細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗細(xì)胞增殖及免疫調(diào)節(jié)作用的分泌性糖蛋白[1]。根據(jù)其與受體相結(jié)合的方式分為I 型、II 型和III 型（IFN-I、IFN-II、IFN-III），其中IFN-ω 與IFN-α、IFN-β 同屬于IFN-I，它們可通過(guò)相同的受體（IFNAR1 和IFNAR2）發(fā)揮一定的生物活性[2]。IFN-ω 主要由白細(xì)胞產(chǎn)生，除了具有與IFN-α 相似的生物學(xué)特性以及類似的抗病毒、抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)功能外，還具有一定程度的跨物種生物學(xué)活性[3]。1992 年，貓ω 干擾素（FeIFN-ω）基因首次被鑒定，1 年后重組FeIFN-ω 制劑在日本生產(chǎn)，主要用于治療貓杯狀病毒病及細(xì)小病毒病，并批準(zhǔn)為抗貓杯狀病毒（FCV）感染的第一個(gè)獸用抗病毒制劑[4]。王鴻賓等人對(duì)比貓IFN-ω 與貓IFN-α 及日本同類干擾素產(chǎn)品，發(fā)現(xiàn)針對(duì)水泡性口炎病毒（VSV）、FCV、犬瘟熱病毒（CDV）和禽流感病毒（AIV）IFN-ω均表現(xiàn)出更高的抗病毒活性和廣泛的細(xì)胞種屬性[5]。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)寵物貓飼養(yǎng)量的大幅度增加，并且貓的多種病毒病如貓傳染性腹膜炎、貓瘟、貓免疫缺陷病等對(duì)寵物貓的健康危害較為嚴(yán)重，以及缺乏有效的疫苗等問(wèn)題，給寵物貓飼養(yǎng)者帶來(lái)困擾[6]。因此，對(duì)高活性FeIFN-ω 治療制劑的需求也進(jìn)一步提高。

分子對(duì)接是運(yùn)用計(jì)算機(jī)及相關(guān)軟件，研究配體小分子和受體生物大分子之間的相互作用方式，預(yù)測(cè)其結(jié)合親和力，從而進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的方法[7]。利用分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)并篩選IFN與IFN授體（IFNAR1/R2）的最佳結(jié)合位點(diǎn)可以提高結(jié)合親和力及IFN 活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有完善的糖基化修飾功能和折疊機(jī)制，可理想地對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后加工、修飾并分泌到細(xì)胞外，相對(duì)于原核、酵母及昆蟲(chóng)細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白活性更接近于天然蛋白，生物學(xué)活性和安全性均明顯增加[8]。慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，達(dá)到持久性表達(dá)[9]。目前，慢病毒已廣泛用于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，生產(chǎn)高活性的外源蛋白[10]。

為了進(jìn)一步提高FeIFN-ω 的生物活性、擴(kuò)大其在臨床上的應(yīng)用，本研究對(duì)FeIFN-ω進(jìn)行突變優(yōu)化并利用293 懸浮細(xì)胞結(jié)合慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)制備突變型干擾素蛋白，經(jīng)生物活性分析，篩選增強(qiáng)型FeIFN-ω，為研發(fā)新型、高效的抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料pJET-FeIFN-ω 重組質(zhì)粒、 貓腎（CRFK）細(xì)胞、293T 細(xì)胞、293 懸浮細(xì)胞（293s）、FCV F9 株和貓皰疹病毒（FHV）HR-1 株、慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreen1、包裝質(zhì)粒psPAX2 和膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G、IFNAR1 及IFNAR2 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；鼠His 單克隆抗體（MAb）、兔myc 多克隆抗體（PAb）購(gòu)自Abcam；山羊抗兔HRP-IgG 和山羊抗鼠HRP-IgG 購(gòu)自美國(guó)LICOR 公司；BCA 蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker 外源蛋白、限制性內(nèi)切酶XhoI 和BamH I 和T4 DNA 連接酶均購(gòu)自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、細(xì)胞總RNA試劑盒購(gòu)自AXYGEN 公司；His 標(biāo)簽蛋白純化樹(shù)脂購(gòu)自天地人和生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11]及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)GenBank 中登錄的FeIFN-ω 基因序列（NM_001102440.1）進(jìn)行突變，利用軟件Oligo7 設(shè)計(jì)3組定點(diǎn)突變引物，引物序列如表1（引物1）。在FeIFN-ω 基因序列的兩端分別添加BamH I 和XhoI 酶切位點(diǎn)（劃線部分）、保護(hù)性堿基以及在基因序列尾部添加His 標(biāo)簽基因序列，設(shè)計(jì)用于構(gòu)建表達(dá)載體的引物，引物序列如下表1（引物2）。引物由吉林庫(kù)美生物公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 FeIFN-ω突變基因的擴(kuò)增、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以pJET-FeIFN-ω 質(zhì)粒為模板，利用引物FeIFN-ω-156-F/R 擴(kuò)增FeIFN-ω 基因、引物FeIFNω-35-F1/F2/R擴(kuò)增FeIFN-ω-R35L基因、引物FeIFNω-156-F/R1/R2 擴(kuò)增FeIFN-ω-A156R 基因、引物FeIFN-ω-188-F/R 擴(kuò)增FeIFN-ω-T188R 基因。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物回收后由吉林庫(kù)美生物公司測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果正確的FeIFN-ω、FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因片段經(jīng)BamH I 和XhoI 酶切后連接至真核表達(dá)載體pLVX-IRES，構(gòu)建重組質(zhì)粒。并利用BamH I 和XhoI雙酶切鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別命名為pLVXFeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R。

1.4 重組質(zhì)粒的慢病毒包裝將293T 細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上，利用PEI 將4個(gè)重組質(zhì)粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R 分別與包裝質(zhì)粒psPAX2、膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，鑒定后收獲細(xì)胞上清，3 000 r/min離心5 min 收集上清，各2 mL 即為包裝好的慢病毒。在-20 ℃暫存。

1.5 目的蛋白的表達(dá)及純化待293s 細(xì)胞達(dá)到1×106個(gè)/mL 時(shí)，將收獲的4 種慢病毒各2 mL 與1 mL 293s 細(xì)胞混勻，用293 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基懸起，總體積為20 mL，用細(xì)胞搖瓶于37 ℃搖床培養(yǎng)6 h～8 h后換液。培養(yǎng)48 h 后吸取100 μL 細(xì)胞至96 孔板，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。每隔3 d，細(xì)胞以1∶2 傳代至新的細(xì)胞搖瓶、并收獲細(xì)胞上清，直至收獲800 mL 上清液。細(xì)胞上清經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，分別用30 mmol/L 咪唑、250 mmol/L 咪唑洗脫后，經(jīng)SDS-PAGE 鑒定，BCA 蛋白濃度測(cè)定后分裝， -80 ℃保存?zhèn)溆?。將獲得的4 個(gè)重組蛋白即重組干擾素分別命名為rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。

1.6 重組干擾素活性的測(cè)定

1.6.1 熒光定量PCR 引物的設(shè)計(jì)與合成 熒光定量PCR 引物由本實(shí)驗(yàn)室保存（表2）。

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2 Primers used for real-time PCR

1.6.2 重組干擾素抗病毒活性的分析 在2 個(gè)24 孔板均鋪104個(gè)CRFK 細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，分別加500 μL 濃度為2 μg/mL 的4 個(gè)重組干擾素，空白對(duì)照不加干擾素，各3 個(gè)復(fù)孔。孵育18 h 后，2 個(gè)細(xì)胞板分別接種FCV（MOI 0.1）和FHV（MOI 0.1）[12]，12 h后分別提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，分別采用引物FCV-F/R、FHV-F/R、18s rRNA-F/R，經(jīng)熒光定量PCR 在RNA 水平檢測(cè)病毒的基因拷貝數(shù)，程序?yàn)椋?5 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)；設(shè)定溶解曲線：95 ℃15 s，60 ℃1 min，75 ℃15 s。以18s rRNA 為內(nèi)參基因，分析4個(gè)重組干擾素的抗病毒活性。

1.6.3 重組干擾素誘導(dǎo)ISGs 轉(zhuǎn)錄活性的分析 在24孔板鋪104個(gè)CRFK 細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，分別加500 μL 濃度為2 μg/mL 的4 個(gè)重組干擾素，空白對(duì)照不加干擾素，各3 個(gè)復(fù)孔。孵育12 h 后分別提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，分別采用引物ISG15-F/R、Viperin-F/R、IFITM1-F/R、18s rRNA-F/R，經(jīng)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞中的干擾素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 的mRNA 水平，程序?yàn)椋?5 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)；設(shè)定溶解曲線：95 ℃15 s，60 ℃1 min，75 ℃15 s。以18s rRNA 為內(nèi)參基因，分析4個(gè)重組干擾素對(duì)干擾素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 表達(dá)量的影響。

1.6.4 重組干擾素與干擾素受體結(jié)合親和力的分析采用Pull-down 方法檢測(cè)rFeIFN-ω和rFeIFN-ω-T188R與干擾素受體IFNAR1 和IFNAR2 的結(jié)合親和力。將293T 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%，分別用PEI 轉(zhuǎn)染IFNAR1、IFNAR2 質(zhì)粒[13]，各2 個(gè)復(fù)孔，48 h 后各加入2 mL 細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。取100 μL濃度為200 μg/mL的重組干擾素rFeIFNω 和rFeIFN-ω-T188R 分別與100 μL His 純化樹(shù)脂結(jié)合3 h，均加入1 mL 的IFNAR1 和IFNAR2 細(xì)胞裂解液，4 ℃結(jié)合過(guò)夜，對(duì)照組不加干擾素。經(jīng)1×PBST 洗滌3 遍，9 000 g 室溫離心3 min；棄PBST 上清液，各加80 μL 1×PBS、20 μL 5×SDS-PAGE Buffer，以鼠源His MAb（1∶1 000）為一抗，山羊抗鼠HRP-IgG（1∶15 000）為二抗，通過(guò)western blot 檢測(cè)rFeIFN-ω 和rFeIFN-ω-T188R 的表達(dá)情況；以兔myc PAb（1∶1 000）為一抗，山羊抗兔HRP-IgG（1∶8 000）為二抗，通過(guò)western blot 檢測(cè)IFNAR1/R2 的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 突變FeIFN-ω基因的擴(kuò)增、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以pJET-FeIFN-ω 質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增FeIFN-ω、FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因，分別經(jīng)BamH I 和XhoI 酶切，連接至慢病毒載體pLVX-IRES，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLVXFeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R，經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，獲得與預(yù)期612 bp 大小相符的目的基因（圖1）?；蛐蛄斜葘?duì)結(jié)果顯示均在相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)堿基突變（圖2）。表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVXFeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

圖2 重組質(zhì)粒基因測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing of recombinant plasmid gene

2.2 重組質(zhì)粒的慢病毒包裝重組質(zhì)粒pLVX-FeIFNω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R 分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞48 h 時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察，均可見(jiàn)大面積的綠色熒光（圖3）。表明獲得了分別包裝有FeIFN-ω、FeIFNω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因的慢病毒。

圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h的293T細(xì)胞中GFP表達(dá)情況Fig.3 The expression of GFP in 293T cells transfected by recombinant plasmid for 48 h

2.3 目的蛋白的表達(dá)及純化收獲的P10 代各慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)293s 細(xì)胞48 h 時(shí)在熒光顯微鏡下觀察，均可見(jiàn)大面積的綠色熒光（圖4），表明各慢病毒均導(dǎo)入293s 細(xì)胞中。收獲的細(xì)胞上清分別利用鎳離子親和層析柱純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 鑒定，結(jié)果顯示，分別獲得約20 ku 目的蛋白（圖5），與預(yù)期大小均相符。BCA法測(cè)rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R蛋白濃度分別為188 μg/mL、255 μg/mL、160 μg/mL、178 μg/mL，表明上述4 個(gè)重組干擾素蛋白在293s 細(xì)胞中均得到高效表達(dá)。

圖4 293s細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒P10代的GFP表達(dá)情況Fig.4 The expression of GFP 293s cells transfected with Lv-eGFP of P10

圖5 重組干擾素蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.5 Identification of recombinant interferon by SDS-PAGE

2.4 生物活性檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 重組干擾素的抗病毒活性 采用相對(duì)熒光定量PCR 法檢測(cè)4個(gè)重組干擾素對(duì)FCV和FHV的復(fù)制的抑制作用，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，差異極顯著，實(shí)驗(yàn)組病毒復(fù)制水平均顯著降低（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 與rFeIFN-ω差異不顯著（P＞0.05），rFeIFN-ω-T188R 與rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 相比病毒的復(fù)制均降低，并且rFeIFN-ω-T188R 抑制FCV 和FHV 復(fù)制的能力均比rFeIFN-ω 增強(qiáng)1 倍左右（圖6）。表明4個(gè)重組干擾素中rFeIFN-ω-T188R 的抗FCV 和FHV活性最高。

2.4.2 重組干擾素誘導(dǎo)ISGs 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè) 采用相對(duì)熒光定量PCR 法檢測(cè)重組干擾素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R分別誘導(dǎo)ISG15、Viperin、IFITM1 的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯著：與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組4 個(gè)重組干擾素誘導(dǎo)的上述4 個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，實(shí)驗(yàn)組中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 與rFeIFN-ω差異不顯著（P＞0.05）或顯著下調(diào)（P＜0.05），rFeIFNω-T188R 與rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 相比均顯著上調(diào)（P＜0.05），并且rFeIFN-ω-T188R 誘導(dǎo)ISG15、Viperin、IFITM1 的轉(zhuǎn)錄水平均比rFeIFN-ω 高1 倍左右（圖7）。表明4 個(gè)重組干擾素中rFeIFN-ω-T188R 誘導(dǎo)干擾素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 的轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)。

圖7 重組干擾素在CRFK細(xì)胞誘導(dǎo)Viperin（A）、ISG15（(B）和IFITM1（C）mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定Fig.7 Viperin(A),ISG15(B)and IFITM1(C)levels induced by recombinant interferon in CRFK cells

2.4.3 重組干擾素與干擾素受體結(jié)合親和力 通過(guò)比較western blot 蛋白條帶灰度值，分析rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-T188R 與IFNAR1 和IFNAR2 的親和力。結(jié)果顯示，rFeIFN-ω-T188R 與干擾素受體IFNAR1 的結(jié)合能力比rFeIFN-ω 高1 倍左右（圖8），而兩者與干擾素受體IFNAR2 的親和力差異不顯著。結(jié)果表明rFeIFN-ω-T188R 的突變?cè)鰪?qiáng)了FeIFN-ω 與其受體IFNAR1 的結(jié)合親和力。

圖8 rFeIFN-ω 和rFeIFN-ω-T188R與干擾素受體IFNAR1/2親和力的western blot 鑒定（A）結(jié)果及蛋白條帶灰度值分析（B）結(jié)果Fig.8 Western blot identification of rFeIFN-ω and rFeIFNω-T188R affinity with IFNAR1/2(A)and protein band density value analysis(B)result

3 討 論

近年來(lái)，干擾素因其高效且廣譜的抗病毒作用被廣泛的作為抗病毒藥物應(yīng)用于臨床治療。目前已知的FeIFN-ω 及其基因工程制品大多在大腸桿菌載體中表達(dá)，但大腸桿菌表達(dá)的干擾素多以包涵體形式存在，操作過(guò)程復(fù)雜且蛋白產(chǎn)物活性低[14]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)克服了原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，且具有完善的糖基化修飾功能和折疊機(jī)制，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后加工、修飾并分泌到細(xì)胞外[15]。利用慢病毒載體介導(dǎo)外源基因進(jìn)入細(xì)胞，具有表達(dá)效率高、安全性高、免疫原性低等優(yōu)勢(shì)，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白的持久、穩(wěn)定表達(dá)[16]。

本研究室前期實(shí)驗(yàn)比較了真核與原核表達(dá)的野生型FeIFN-ω 生物活性，結(jié)果顯示哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的干擾素抗病毒活性高于原核表達(dá)。目前，基于分子對(duì)接的計(jì)算機(jī)篩選技術(shù)在研制新藥方面應(yīng)用十分廣泛，近期羅才榮等人利用分子對(duì)接技術(shù)成功篩選了一種高效的抗炎活性生物堿[7]。本研究通過(guò)分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)和參考黃麗等對(duì)豬干擾素的相關(guān)研究對(duì)FeIFN-ω 氨基酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變[11]，選擇了3 個(gè)突變點(diǎn)R35L、A156R、T188R。利用慢病毒載體pLVX-IRSE 分別介導(dǎo)FeIFN-ω、FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因進(jìn)入293T 細(xì)胞，在293T 細(xì)胞中成功包裝慢病毒后轉(zhuǎn)導(dǎo)293s 細(xì)胞，在293s 細(xì)胞高效表達(dá)了rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。在一些國(guó)內(nèi)外的報(bào)道中，293s 細(xì)胞是最常用的生產(chǎn)高滴度慢病毒的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，吳全德等利用懸浮培養(yǎng)的293s 細(xì)胞生產(chǎn)重組腺病毒載體Ad-IFNγ，并取得了良好的效果[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物活性檢測(cè)分析，在CRFK 細(xì)胞中4 個(gè)重組干擾素均發(fā)揮了一定的抗病毒作用，其中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 與rFeIFN-ω 相比，抗FCV 和FHV 活性及誘導(dǎo)干擾素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 的轉(zhuǎn)錄活性均無(wú)明顯增強(qiáng)，并且個(gè)別呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。相關(guān)研究表明某些位點(diǎn)的突變會(huì)破壞干擾素與干擾素受體結(jié)合的穩(wěn)定性，縮短誘導(dǎo)干擾素的持續(xù)時(shí)間，使二者結(jié)合的親和力降低，生物活性也相應(yīng)的減弱[18]。因此，本研究選擇抗FCV 和FHV 活性及誘導(dǎo)ISGs 轉(zhuǎn)錄活性均增強(qiáng)的rFeIFN-ω-T188R 進(jìn)一步檢測(cè)其與干擾素受體的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，T188R 突變促進(jìn)了FeIFN-ω 與其受體IFNAR1 的結(jié)合，提高了ISGs 的表達(dá)量，增強(qiáng)了FeIFN-ω 的抗病毒活性?？赡苁谴宋稽c(diǎn)的突變使FeIFN-ω 誘導(dǎo)的持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，能與細(xì)胞表面受體長(zhǎng)時(shí)間的緊密結(jié)合，從而發(fā)揮更強(qiáng)的抗病毒作用[18]。

本研究獲得了相對(duì)于野生型FeIFN-ω 抗病毒、誘導(dǎo)ISGs 表達(dá)等活性均顯著提高的增強(qiáng)型貓ω 干擾素FeIFN-ω-T188R，為進(jìn)一步研制高效的抗病毒制劑和免疫增強(qiáng)劑提供參考依據(jù)和研究手段。