張 芹，衛(wèi) 兵，王文艷

0 引 言

子癇前期(preeclampsia，PE) 是妊娠20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿的一種妊娠并發(fā)癥，是圍產(chǎn)期孕產(chǎn)婦發(fā)病和死亡的主要原因，約占全球發(fā)病率的4%-5%[1-2]。懷孕使女性更易患肺水腫、肝腎衰竭、癲癇、腦出血甚至死亡，PE則嚴(yán)重危害的母嬰健康。研究表明，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞在胎盤(pán)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)能力差被認(rèn)為是PE發(fā)生的主要原因[3]。目前，導(dǎo)致PE廣泛的危險(xiǎn)因素包括遺傳、環(huán)境和社會(huì)因素等，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。因此，亟待探究PE的病理機(jī)制，以期為臨床治療提供更有效的方法。長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNAs)是指長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸且不具有編碼蛋白功能的轉(zhuǎn)錄本，與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究報(bào)道，LINC00511位于17q24.3染色體上，與人類(lèi)多種癌癥和PE進(jìn)展密切相關(guān)。LINC00511在PE患者胎盤(pán)組織中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)LINC00511可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]。敲除LINC00511后，細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖以及自噬過(guò)程均受到抑制，同時(shí)促使細(xì)胞大量凋亡[5]。研究表明，miR-16-5p可逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)LINC00473對(duì)HTR8/SVneo和JEG-3細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用[6]。在PE大鼠模型中，川芎嗪通過(guò)調(diào)控miR-16-5p/IGF-2軸抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞存活和遷移[7]。然而LINC00511對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的影響及其機(jī)制是否與miR-16-5p有關(guān)尚未完全明確。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究LINC00511是否通過(guò)靶向調(diào)控miR-16-5p表達(dá)來(lái)影響HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT。

1 材料與方法

1.1 組織來(lái)源選取2016年1月至2019年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科60例剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的的胎盤(pán)組織。胎盤(pán)組織收集自壞死區(qū)以外的胎盤(pán)裂片中，保存在-80 ℃液氮中。其中30例產(chǎn)婦符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，每位受試者均無(wú)其它妊娠并發(fā)癥。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PJ-YX2018-031)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2材料人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/Svneo購(gòu)自美國(guó)的ATCC細(xì)胞庫(kù)；胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；Matrigel膠、Transwell小室購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)BD公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；從北京百奧萊博科技有限公司購(gòu)買(mǎi)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒；從上海索寶生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)pcDNA-NC、pcDNA-LINC00511；anti-miR-NC、anti-miR-16-5p、miR-NC、miR-16-5p、si-NC、si-LINC00511購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)HTR-8/Svneo細(xì)胞，培養(yǎng)基中含有鏈霉素、10% 胎牛血清、青霉素，在恒溫37 ℃以及5% CO2條件下培養(yǎng)，直至細(xì)胞90% 融合度時(shí)，進(jìn)行傳代。將pcDNA-NC、pcDNA-LINC00511、anti-miR-NC、anti-miR-16-5p、si-NC、si-LINC00511分別轉(zhuǎn)染至HTR-8/Svneo細(xì)胞中，記為pcDNA-NC組、pcDNA-LINC00511組、anti-miR-NC組、anti-miR-16-5p組、si-NC組、si-LINC00511組；pcDNA-LINC00511分別與miR-NC、miR-16-5p共轉(zhuǎn)染至HTR-8/Svneo細(xì)胞中，記為pcDNA-LINC00511+miR-NC組、pcDNA-LINC00511+miR-16-5p組。

1.4RT-qPCR提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，LINC00511、miR-16-5p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，以2-△△Ct法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。LINC00511上游引物序列：5′-CTAACAAGAGGGTAAGTGTCAG-3′，下游引物序列：5′-AAGTCGACAACCCCATCGTTAC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游引物序列：5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3′；miR-16-5p上游引物序列：5′-TCCACTCTAGCAGCACGTAAAT-3′，下游引物序列：5′-TCACACTAAAGCAGCACAGTAAT-3′；U6上游引物序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；由上海生工生物工程公司負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)引物的合成工作。

1.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移與侵襲HTR-8/Svneo細(xì)胞接種至Transwell小室中，小室中鋪有基質(zhì)凝膠，2×104個(gè)/孔，培養(yǎng)基為DMEM/F12，其中含10%胎牛血清，在37 ℃恒溫條件下持續(xù)孵育，24 h后使用棉簽擦去濾膜上層膠以及細(xì)胞，多聚甲醛固定，染色溶液為0.1%結(jié)晶紫染液，染色后置于顯微鏡下觀(guān)察，對(duì)各組細(xì)胞的侵襲、遷移情況進(jìn)行記錄。

1.6Western blot法測(cè)定蛋白的表達(dá)水平對(duì)各組細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行提取、定量分析，試劑盒為BCA試劑盒。按照60 μg/孔實(shí)施SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗在室溫條件下持續(xù)孵育，1 h后進(jìn)行顯影以及定影處理，以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白條帶灰度值，軟件為ImageJ。

1.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)構(gòu)建LINC00511野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-LINC00511和MUT-LINC00511，將其分別與miR-NC和miR-16-5p共轉(zhuǎn)染至HTR-8/Svneo細(xì)胞，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)工作。

2 結(jié) 果

2.1 PE組織中的LINC00511、miR-16-5p表達(dá)水平差異PE胎盤(pán)組織LINC00511表達(dá)水平(0.45±0.03)較正常胎盤(pán)組織(1.01±0.05)顯著降低(P<0.05)，miR-16-5p的表達(dá)水平(2.93±0.15)較正常胎盤(pán)組織(0.99±0.07)顯著升高(P<0.05)。

2.2HTR-8/Svneo細(xì)胞LINC00511表達(dá)上調(diào)對(duì)遷移、侵襲和EMT水平的影響pcDNA-LINC00511組LINC00511表達(dá)水平較pcDNA組明顯升高，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2，表1。

圖1 上調(diào)LINC00511表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲的影響

1: pcDNA組;2: pcDNA-LINC00511組

表1 上調(diào)LINC00511表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移侵襲及EMT的影響

2.3LINC00511對(duì)miR-16-5p表達(dá)水平的靶向調(diào)控作用StarBase預(yù)測(cè)顯示，miR-16-5p與LINC00511部分序列互補(bǔ)，見(jiàn)圖3。相比于WT-LINC00511轉(zhuǎn)染miR-NC后的雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果，轉(zhuǎn)染miR-16-5p的熒光素酶活性(0.41±0.02)較miR-NC(1.01±0.04)顯著降低(P<0.05)，而在MUT-LINC00511中，轉(zhuǎn)染miR-NC(0.99±0.04)和miR-16-5p的熒光素酶活性(1.02±0.06)無(wú)顯著差異(P>0.05)。pcDNA-LINC00511組miR-16-5p表達(dá)水平較pcDNA組明顯降低(P<0.05)；si-LINC00511組miR-16-5p表達(dá)水平較si-NC組明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖3 miR-16-5p與LINC00511部分序列互補(bǔ)

表2 LINC00511調(diào)控miR-16-5p表達(dá)

2.4HTR-8/Svneo細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)下調(diào)對(duì)遷移、侵襲、EMT的影響與anti-miR-NC組比較，anti-miR-16-5p組miR-16-5p的表達(dá)水平顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4、圖5，表3。

圖4 抑制miR-16-5p表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲的影響

1：anti-miR-NC組； 2：anti-miR-16-5p組

表3 抑制miR-16-5p表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移侵襲及EMT的影響

圖 7 過(guò)表達(dá)miR-16-5p逆轉(zhuǎn)了上調(diào)LINC00511表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲的影響Figure 7 Overexpression of miR-16-5preversed the effect of up-regulated LINC00511 expression on migration, invasion and EMT of HTR-8/Svneo cells

2.5過(guò)表達(dá)miR-16-5p逆轉(zhuǎn)了上調(diào)LINC00511表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移侵襲和EMT的影響與pcDNA-LINC00511+miR-NC組比較，pcDNA-LINC00511+miR-16-5p組miR-16-5p的表達(dá)水平顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6、圖7，表4。

1: pcDNA組;2: pcDNA-LINC00511組;3: pcDNA-LINC00511+miR-NC組;4: pcDNA-LINC00511+miR-16-5p組

表4 過(guò)表達(dá)miR-16-5p逆轉(zhuǎn)了上調(diào)LINC00511表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移侵襲及EMT的影響

3 討 論

PE是一種多系統(tǒng)的妊娠綜合征，與孕產(chǎn)婦和嬰兒高發(fā)病率和死亡率有關(guān)。在正常妊娠的母體螺旋動(dòng)脈重構(gòu)過(guò)程中，動(dòng)脈轉(zhuǎn)化為大直徑、低阻力的血管，為絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞提供穩(wěn)定的母體血液灌注[9-10]。滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲失敗可能導(dǎo)致螺旋動(dòng)脈重構(gòu)不足，在PE發(fā)病機(jī)制中起重要作用。研究報(bào)道，lncRNAs參與人類(lèi)多種疾病的發(fā)病機(jī)制，包括腫瘤、心肌梗死、糖尿病腎病和神經(jīng)退行性疾病等。越來(lái)越多研究表明，lncRNAs在PE發(fā)生發(fā)展中的作用，如lncRNA AGAP2-AS1在重度PE胎盤(pán)組織中異常下調(diào)，lncRNA AGAP2-AS1的下調(diào)抑制滋養(yǎng)層的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，參與了PE的發(fā)展[11]。lncRNA AK002210可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移侵襲，敲減lncRNA AK002210通過(guò)miR-590-3p/NAIP和ERK/MMP信號(hào)通路在PE進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。lncRNA MALAT1通過(guò)FOS誘導(dǎo)的EMT促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲[13]。lncRNA SNHG12促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與MMP-2、MMP-9、β-catenin、Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[14]。lncRNA SNHG14在PE胎盤(pán)組織中低表達(dá)，上調(diào)lncRNA SNHG14促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT[15]。過(guò)表達(dá)lncRNA HOXA-AS2可增強(qiáng)HTR-8/SVneo細(xì)胞的侵襲、遷移以及EMT過(guò)程[16]。LINC00511在口腔癌、乳腺癌、骨肉瘤、宮頸癌、結(jié)直腸癌等中發(fā)揮腫瘤致癌基因作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC00511在PE胎盤(pán)組織中低表達(dá)，上調(diào)LINC00511表達(dá)促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT，顯著升高M(jìn)MP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表達(dá)水平，降低E-cadherin的表達(dá)水平。提示上調(diào)LINC00511表達(dá)可促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT。

研究表明，lncRNAs可作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA負(fù)調(diào)控miRNA表達(dá)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡。StarBase預(yù)測(cè)顯示miR-16-5p與LINC00511部分序列互補(bǔ)，在WT-LINC00511中，miR-16-5p組的雙熒光素酶活性顯著降低，且過(guò)表達(dá)和抑制LINC00511分別顯著降低和提高miR-16-5p的表達(dá)水平，即LINC00511靶向負(fù)調(diào)控miR-16-5p的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR的異常表達(dá)與PE進(jìn)展有關(guān)。如miR-200b可通過(guò)靶向調(diào)控SOX2蛋白表達(dá)影響HTR-8/Svneo細(xì)胞的侵襲和遷移能力[17]。miR-574的上調(diào)抑制了HTR-8/Svneo細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。miR-182-5p在PE胎盤(pán)組織和HTR-8/SVneo細(xì)胞中高表達(dá)，hsa_circ_0007121通過(guò)miR-182-5p/PGF軸促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT[19]。在從PE組織分離的和缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中，miR-141-3p表達(dá)上調(diào)，下調(diào)miR-141-3p表達(dá)可促進(jìn)HUVECs的存活、小管形成和遷移侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，消除缺氧對(duì)HUVECs的影響[20]。黃芩苷通過(guò)下調(diào)miR-155-5p表達(dá)，可以使滋養(yǎng)層細(xì)胞快速增殖，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的遷移、侵襲過(guò)程起到促進(jìn)作用。與上述研究數(shù)據(jù)相符，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明PE胎盤(pán)組織中的miR-16-5p呈現(xiàn)高水平表達(dá)，抑制miR-16-5p表達(dá)促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT，顯著升高M(jìn)MP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表達(dá)水平，降低E-cadherin的表達(dá)水平。提示抑制miR-16-5p表達(dá)可促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT。且過(guò)表達(dá)miR-16-5p逆轉(zhuǎn)了上調(diào)LINC00511表達(dá)對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞遷移侵襲和EMT的影響，HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT能力下降，MMP-2、MMP-9、Vimentin、N-cadherin和Twist1的表達(dá)水平降低，E-cadherin的表達(dá)水平升高。提示LINC00511可能通過(guò)調(diào)控miR-16-5p表達(dá)影響HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT。

綜上所述，LINC00511在PE胎盤(pán)組織中低表達(dá)，上調(diào)LINC00511表達(dá)可能通過(guò)靶向下調(diào)miR-16-5p表達(dá)促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞的遷移侵襲和EMT。