周婷婷，楊 展，常永和，周東明，朱 進(jìn)，鄭 峰

0 引 言

基孔肯雅病毒(Chikungimya virus，CHIKV)為RNA病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬，可通過(guò)伊蚊傳播感染人導(dǎo)致基孔肯雅熱?；颊咧饕Y狀為發(fā)熱、皮疹和關(guān)節(jié)炎等，發(fā)熱體溫一般高于39℃，皮疹癥狀3～4 d后消失，但關(guān)節(jié)炎癥狀可能持續(xù)存在數(shù)年，少數(shù)人并發(fā)腦炎導(dǎo)致死亡[1-3]。基孔肯雅熱過(guò)去主要分布于非洲和東南亞地區(qū)，但隨著全球氣溫升高和經(jīng)貿(mào)交流頻繁，作為基孔肯雅病毒傳播媒介的埃及伊蚊和白紋伊蚊活動(dòng)范圍擴(kuò)大，該病逐漸呈現(xiàn)出大范圍流行的趨勢(shì)。我國(guó)于2008年首次報(bào)道了基孔肯雅熱輸入病例[4]，2010 年在東莞市發(fā)生基孔肯雅熱聚集性疫情，報(bào)告病例200余人，此外在云南省、浙江省等地也曾出現(xiàn)疑似病例[5-6]。

CHIKV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括病毒分離培養(yǎng)、核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)，每種方法各有其優(yōu)勢(shì)和局限性。血清學(xué)檢測(cè)方法可在病毒血癥期間用于檢測(cè)病毒抗原或抗體，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但在檢測(cè)同一血清學(xué)組的病毒時(shí)可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)?，F(xiàn)已有針對(duì)CHIKV的商品化IgM-ELISA檢測(cè)試劑盒[7]，但由于人感染CHIKV通常要在5 d后產(chǎn)生IgM抗體[8]，因此不適用于臨床早期診斷。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)檢測(cè)CHIKV抗原的免疫學(xué)方法研究尚少，如邢驍躍等[9]利用CHIKV病毒樣顆粒免疫制備小鼠和兔多克隆抗體，建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)CHIKV抗原的方法。CHIKV基因組共編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP1～nsP4)和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、6K和3個(gè)包膜糖蛋白E1、E2和E3)，非結(jié)構(gòu)蛋白的功能主要是參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，其中nsP1具有甲基酶轉(zhuǎn)移活性，主要負(fù)責(zé)病毒負(fù)鏈RNA的合成[10]。本研究擬以nsP1蛋白為靶向分子制備檢測(cè)抗體，建立雙抗夾心法ELISA和膠體金免疫層析法檢測(cè)CHIKV抗原，為我國(guó)的CHIKV現(xiàn)場(chǎng)快速免疫學(xué)檢測(cè)方法提供技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)、pET28a+、Sp2/0細(xì)胞為本科實(shí)驗(yàn)室保存。Balb/c(6～8周齡)小鼠購(gòu)自上海史萊克公司。High affinityNi-NTAresion、Protein G resin為GE公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑和不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；鼠源anti-His抗體、羊抗鼠IgG單克隆抗體購(gòu)于南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司公司；DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒、限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)于TaKaRa生物工程有限公司；Glue活化辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記試劑盒購(gòu)自星寶生物技術(shù)有限公司。寨卡病毒NS1蛋白為本室前期研究制備，CHIKV 感染動(dòng)物血清由南部戰(zhàn)區(qū)疾控中心惠贈(zèng)。本實(shí)驗(yàn)引物合成和DNA產(chǎn)物測(cè)序均由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 基孔肯雅病毒nsP1重組蛋白的制備根據(jù)Genbank中公布的CHIKV基因組序列(GenBank: NC_004162.2)，人工合成nsP1蛋白編碼基因，并根據(jù)大腸埃希菌的密碼子偏嗜性對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，克隆入原核表達(dá)載體pET28a+中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)化菌以0.1 mmol/L終濃度IPTG分別在15 ℃下誘導(dǎo)16 h或在37 ℃下誘導(dǎo)4 h，離心后收集菌體沉淀，超聲破碎后，用12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)情況。確定重組蛋白以包涵體形式表達(dá)后，收集超聲離心后的細(xì)胞沉淀，加入8 mol/L尿素懸浮溶解包涵體，離心半徑9.5 cm、12 000 r/min離心30 min，上清液用His Trap TMHP親和吸附柱進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)透析復(fù)性將純化的蛋白透析到pH 7.4的0.01 mol/L PBS中，PEG-20000濃縮，SDS-PAGE和Western blot鑒定蛋白純度。

1.3 單克隆抗體的制備與鑒定用純化獲得的nsP1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，參照文獻(xiàn)[11]的方法將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，ELISA篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，按照2×106/只注入經(jīng)滅菌液體石蠟(0.5mL/只)預(yù)處理的經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔制備腹水。按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟純化腹水，離心半徑10.8 cm、22 000 r/min離心30 min，收集上清并記錄濾液的體積，向?yàn)V液中加入2倍體積的60 mmol/L 的醋酸鈉緩沖液，pH 4.0；加入NaOH調(diào)節(jié)pH 至4.8；逐滴加入辛酸(按照每10 毫升腹水體積加入0.4 mL辛酸)，邊加邊攪拌，于室溫下攪拌30 min；離心半徑10.8 cm、22 000 r/min離心30 min，棄去沉淀，上清用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，再次離心30 min 后，上清用1倍體積PBS 稀釋后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，經(jīng)Protein G柱純化。SDS-PAGE檢測(cè)純化抗體的純度，并用2 μg/mL nsP1蛋白包被ELISA板，將抗體倍比稀釋后通過(guò)ELISA檢測(cè)抗體與nsP1蛋白的結(jié)合能力。

1.4 建立雙抗體夾心法檢測(cè)抗原按照上述單克隆抗體制備方法共獲得了6株抗nsP1單克隆抗體。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)純化的6株單抗進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記，棋盤(pán)法進(jìn)行雙抗體夾心檢測(cè)抗原，篩選出配對(duì)的捕獲抗體和檢測(cè)抗體，具體方法如下：分別以6種抗體100 ng/孔包被酶聯(lián)板，每孔加入20ng nsP1抗原起始，梯度稀釋加入酶聯(lián)板中，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5遍，將HRP標(biāo)記的抗nsP1抗體按照1∶500起始梯度稀釋加入每孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5遍，加入顯色液顯色，測(cè)定A450處的吸光度值。同時(shí)，以寨卡病毒NS1蛋白作為陰性對(duì)照平行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.5 建立免疫層析方法檢測(cè)CHIKV抗原將所篩選得到的捕獲抗體噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)帶，將商品化的羊抗鼠IgG噴涂于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控帶。將檢測(cè)抗體標(biāo)記膠體金，制備相應(yīng)的免疫層析試劑。用不同濃度的nsP1抗原或CHIKV感染動(dòng)物血清進(jìn)行免疫層析檢測(cè)，以PBS溶液作為空白對(duì)照，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié) 果

2.1 基孔肯雅病毒重組nsP1蛋白的表達(dá)和純化將構(gòu)建成功的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)中，經(jīng)過(guò)IPTG在不同溫度下誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)，見(jiàn)圖1。因此我們選擇在15 ℃條件下大量培養(yǎng)誘導(dǎo)16 h，超聲裂解收集包涵體，使用8 mol/L尿素變性，經(jīng)鎳柱親和層析純化后，透析復(fù)性得到純化的重組蛋白nsP1相對(duì)分子質(zhì)量約為45 000，濃度約為0.8 mg/mL，見(jiàn)圖2a。用anti-His抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，證明該蛋白確為表達(dá)的重組蛋白，見(jiàn)圖2b。

2.2 抗nsP1特異性抗體的純化和鑒定使用重組nsP1蛋白免疫小鼠，按照常規(guī)方法制備雜交瘤細(xì)胞株，篩選得到6株高表達(dá)抗nsP1單克隆抗體的陽(yáng)性克隆株，編號(hào)分別為nsP1-102、nsP1-1C312、nsP1-2A302、nsP1-1A201、nsP1-1D601、nsP1-1B101。制備小鼠腹水，經(jīng)Protein G親和層析柱純化，SDS-PAGE檢測(cè)顯示純化得到的抗體純度均達(dá)到95%以上，見(jiàn)圖3a。非競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，抗體經(jīng)過(guò)梯度稀釋之后，ELISA反應(yīng)得到的A450值呈規(guī)律性變化，與抗體濃度的改變趨勢(shì)相同，證明純化的抗nsP1單抗與重組蛋白有很好的結(jié)合能力，見(jiàn)圖3b。

M: Protein marker; 1: 未誘導(dǎo)的全細(xì)胞; 2: 15 ℃誘導(dǎo)16 h的全細(xì)胞; 3: 37 ℃誘導(dǎo)4 h的全細(xì)胞;4:未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解上清; 5: 15 ℃誘導(dǎo)16 h的細(xì)胞裂解上清; 6:37 ℃誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解上清; 7:未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解沉淀; 8: 15 ℃誘導(dǎo)16 h的細(xì)胞裂解沉淀; 9: 37 ℃誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解沉淀圖1 nsP1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件分析Figure 1 Analysis of prokaryotic induced expression conditions of nsP1 protein

M:蛋白marker; 1:BSA(2 μg); 2、3:純化的nsP1蛋白a：SDS-PAGE檢測(cè); b：Western blot檢測(cè)圖2 基孔肯雅病毒nsP1重組蛋白的純化與檢測(cè)Figure 2 Purification and detection of nsP1 recombinant protein

M: 蛋白marker; 1: 純化的抗nsP1單抗a：SDS-PAGE檢測(cè)；b：ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)圖3 抗nsP1單克隆抗體的鑒定Figure 3 Identification of monoclonal antibody against nsp1

2.3 雙抗體夾心法檢測(cè)nsP1抗原單抗nsP1-1A201和HRP標(biāo)記的單抗nsP1-102能夠通過(guò)雙抗體夾心法檢測(cè)出基孔肯雅nsP1抗原，最低檢出值約為1.25 ng，而以同樣濃度的寨卡病毒NS1蛋白作為對(duì)照，則檢測(cè)結(jié)果均為陰性，見(jiàn)圖4。表明該方法具備較好的特異性。

圖4 雙抗體夾心法檢測(cè)nsP1抗原

2.4 雙抗夾心免疫層析試劑的檢測(cè)本研究制備的膠體金試紙條可檢測(cè)出1ng的nsP1抗原，而PBS溶液檢測(cè)為陰性。此外，我們還用該方法對(duì)2份CHIKV感染動(dòng)物血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性。上述實(shí)驗(yàn)表明我們成功建立了能快速檢測(cè)CHIKV的膠體金免疫層析方法。

3 討 論

由于人感染基孔肯雅病毒后多為隱性，而且其傳播媒介和臨床表現(xiàn)都與登革熱等蟲(chóng)媒病相似，少數(shù)患者出現(xiàn)的發(fā)熱、出疹、結(jié)膜炎和關(guān)節(jié)痛等臨床癥狀均不具有特異性，導(dǎo)致患者在感染早期發(fā)生誤診漏診的情況，從而影響了臨床治療和疫情控制[12]。因此，CHIKV感染的確診需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果(如核酸診斷、免疫學(xué)診斷)。雖然熒光定量PCR檢測(cè)具有高特異性和高敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但高度依賴專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)人員，不適于在基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和野外條件下開(kāi)展，所以研發(fā)基于抗原/抗體特異性識(shí)別的CHIKV免疫學(xué)快速檢測(cè)方法，對(duì)于該病的早期防控具有重要意義。

與結(jié)構(gòu)蛋白相比，基孔肯雅病毒的nsP1氨基酸序列較為保守[13]，與其他易產(chǎn)生誤診的病毒如登革、黃熱病毒等同源性低，同時(shí)可刺激宿主產(chǎn)生T細(xì)胞免疫以及體液免疫應(yīng)答[14-16]，是一種較為理想的免疫學(xué)診斷靶向分子。此外，由于nsP1在基孔肯雅病毒的RNA復(fù)制過(guò)程中至關(guān)重要，因而也被視為治療CHIKV感染的潛在靶點(diǎn)[13,17]。本研究選取基孔肯雅病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1作為檢測(cè)靶點(diǎn)，構(gòu)建載體原核表達(dá)純化得到了重組nsP1蛋白，制備了6株抗nsP1單克隆抗體，并篩選配對(duì)抗體建立了針對(duì)CHIKV抗原的雙抗夾心ELISA和免疫層析檢測(cè)方法，為開(kāi)發(fā)適用于基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)和出入境檢疫部門(mén)的簡(jiǎn)便、廉價(jià)的CHIKV檢測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ)。下一步我們將對(duì)免疫層析相關(guān)的所有固相材料和液相反應(yīng)體系進(jìn)行系統(tǒng)篩選和優(yōu)化，以獲得最優(yōu)的敏感性與特異性。