楊小彤，葉靈通，盧 潔，姚 托，王江勇，付耀武，張其中

1.天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津 300462

2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3.惠州學院，廣東 惠州 516007

4.暨南大學/水生生物研究中心/熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心，廣東 廣州 510632

廣東沿海地區(qū)海岸線廣闊、島嶼眾多，海岸線長達3 465.40 km，是漁業(yè)養(yǎng)殖大省。廣東省貝類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達，2019年海水養(yǎng)殖面積達1.65×105hm2，約占全國的8%，居全國第四[1]；2019年貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量為199.24萬噸，約占全省海水養(yǎng)殖產(chǎn)量的58%[1]。但是，近年以來隨著養(yǎng)殖歷史的延長、養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，貝類病害頻發(fā)，嚴重影響貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2-4]。2019年，貝類病害經(jīng)濟損失為95.10億元，約占全國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害損失的23.31%[5]。

派琴蟲 (Perkinsusspp.) 隸屬于頂復門、派琴蟲綱、派琴蟲目、派琴蟲科、派琴蟲屬，是貝類中一類強致病性原生動物病原，可引發(fā)貝殼閉合障礙、生長緩慢、性腺發(fā)育減緩以及配子減少等病癥，高強度感染時甚至會引起貝類大規(guī)模死亡，是嚴重威脅貝類養(yǎng)殖的寄生蟲之一[6]。鑒于派琴蟲的嚴重危害性，其中一部分派琴蟲被世界動物衛(wèi)生組織 (Office International des Epizooties, OIE) 列入軟體動物疫病名錄，一旦發(fā)現(xiàn)感染需要向OIE通報。在中國，派琴蟲病也被列入《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》中二類傳染病下的寄生蟲病中的水生動物疫病之一。世界各地有諸多派琴蟲病害導致貝類大量死亡的報道。如奧爾森派琴蟲 (P.olseni)在日本及韓國人工養(yǎng)殖和野生的菲律賓蛤仔體內(nèi)廣泛傳播，導致了大規(guī)模死亡[7]。海水派琴蟲 (P.marinus) 曾造成墨西哥海岸的牡蠣大量死亡，死亡率高達50%[8]。美國切薩皮克海灣的牡蠣由于感染了派琴蟲，導致產(chǎn)量大幅下降[9]。自1997年以來，中國相繼報道了派琴蟲感染櫛孔扇貝 (Azumapecten farreri)、蝦夷扇貝 (Mizuhopecten yessoensis)、皺紋盤鮑 (Haliotis discus hannai) 和菲律賓蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 等貝類的病例[10]。尤其在2000年，中國沿海黃河北岸灘涂養(yǎng)殖的菲律賓蛤仔發(fā)生了奧爾森派琴蟲感染導致大規(guī)模死亡事件，造成嚴重的經(jīng)濟損失[11]。

貝類一般在開放式的淺?；驗┩可橡B(yǎng)殖，一旦發(fā)生病害，傳統(tǒng)的封閉式養(yǎng)殖常用的藥物浸泡治療方式難以奏效[12]。因此，貝類病害防治主要采用以防為主、治療為輔的方針[13]。摸清貝類派琴蟲感染“家底”，調查派琴蟲的流行感染規(guī)律對貝類派琴蟲病的發(fā)生、發(fā)展和防治顯得尤為重要。但是，相對于貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量和規(guī)模較大的廣東沿海，派琴蟲的流行病學調查相關研究相對單薄，而其重要致病性近年來對廣東貝類養(yǎng)殖的影響卻不容忽視[14]。Cui等[15]曾對廣東湛江的尖紫蛤 (Soletellina acuta) 進行了派琴蟲流行病學調查，發(fā)現(xiàn)2種派琴蟲在同一月份同時感染現(xiàn)象，2種派琴蟲呈現(xiàn)出不同的感染趨勢。而對于廣東沿海大多數(shù)主養(yǎng)貝類品種，如香港牡蠣、海灣扇貝 (Argopecten irradias)、雜色鮑等，其派琴蟲的流行規(guī)律并不清楚，不同的貝類種類具有不同的養(yǎng)殖方式和養(yǎng)殖環(huán)境，這也將不可避免地影響派琴蟲的傳播機制[16]。因此，弄清不同貝類的派琴蟲流行感染規(guī)律，對為不同貝類制定獨特的防治措施至關重要，勢在必行。本研究主要通過調查廣東沿海的主要經(jīng)濟貝類，弄清不同貝類派琴蟲感染的時空變化規(guī)律，掌握派琴蟲病的發(fā)生和流行規(guī)律，以期為該區(qū)域的貝類養(yǎng)殖業(yè)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2020年4月—2021年2月進行周年樣品采集，在貝類疾病潛在高發(fā)期 (4—8月) 每月采集1次，疾病低發(fā)期 (10—2月) 每2個月采集1次，共8次。采集時間劃分為夏秋季 (6—8月、10月)和冬春季 (12月、2月、4—5月)。采集地點分別為廣東粵西沿海3個主要養(yǎng)殖區(qū) (湛江市、陽江市、江門市) 和粵東沿海3個主要養(yǎng)殖區(qū) (汕尾市、揭陽市、汕頭市，圖1)。采集的貝類種類包括香港牡蠣 (Crassostrea hongkongensis)、華貴櫛孔扇貝 (Chlamys nobilis)、馬氏珠母貝 (Pinctada martensii)、雜色鮑 (H.diversicolor)、福建牡蠣(C.angulate)。在每個采集地點每一種貝類隨機挑選30只 (表1)，將每個貝類樣品的鰓取出，固定于無水乙醇中，用于后續(xù)分子鑒定；流行病學調查期間采集海域水體的鹽度和溫度變化情況見圖2。

圖1 廣東省采樣點分布圖Fig.1 Sampling sites along coastal area of Guangdong Province

圖2 廣東近岸海域貝類寄生派琴蟲流行病學調查期間采集海域水體的鹽度和溫度變化Fig.2 Variation of water salinity and temperature in sampling locations during epidemiology investigation of Perkinsus spp.in shellfish along coastal area of Guangdong Province

表1 廣東近岸海域貝類寄生派琴蟲流行病學調查采樣信息Table 1 Sampling information for epidemiology investigation of Perkinsus spp.in shellfish along coastal area of Guangdong Province

1.2 樣品鑒定

1.2.1 總 DNA 的提取、擴增與測序

切取30～50 mg鰓部樣品放置于2 mL離心管內(nèi)，放入通風櫥加速乙醇風干。參照軟體動物組織DNA抽提試劑盒 (美基生物，廣州) 的使用說明進行樣品DNA提取，使用派琴蟲屬通用引物對PerkITS-85 (5'-CCGCTTTGTTTGGMTCCC-3') 和PerkITS-750 (5'-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3')擴增派琴蟲的核糖體RNA基因轉錄間隔區(qū)1 (ITS-1) 序列[15]，目的序列長度為703 bp。PCR擴增體系為 25 μL，包括 2 μL 模板 DNA、12.5 μL PCR Mix (東盛，廣州)、上下游引物各 1 μL (10 μmol·L–1)、滅菌雙蒸水8.5 μL。擴增反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。每次檢測實驗均同時設置陽性對照 (模板為北海派琴蟲質粒)和陰性對照 (模板為無菌蒸餾水)。擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，將單一條帶的PCR樣品進行測序。

1.2.2 派琴蟲物種鑒定

檢查測序得到的序列圖，根據(jù)測序峰圖手動校準序列，確保其準確性。在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索待鑒定物種的序列以進行相似性比較。當目標序列與數(shù)據(jù)庫中已確定物種序列的相似度為99.5%～100%時，認為待鑒定物種與數(shù)據(jù)庫中的匹配物種相同[15]。

1.3 感染率統(tǒng)計與分析

貝類派琴蟲感染率的定義參考Bush等[17]和李文祥[18]，指感染派琴蟲的貝類數(shù)量占該檢測貝類樣品總量的比例。貝類派琴蟲總感染率是指該檢測貝類樣品中所有感染派琴蟲種類的貝類數(shù)量占該檢測貝類樣品總量的比例。實驗數(shù)據(jù)采用R軟件包進行統(tǒng)計分析，不同時間、地點、貝類宿主間派琴蟲感染率的顯著性差異用卡方檢驗，顯著性水平設置為0.05。利用R語言ggplot2 軟件包進行圖片繪制。

2 結果

2.1 派琴蟲及其貝類宿主多樣性

在廣東沿海中共檢測到2種派琴蟲，分別為北海派琴蟲和奧爾森派琴蟲，其中北海派琴蟲為優(yōu)勢感染種類，總感染率為9.0% (N=2 400)，顯著高于奧爾森派琴蟲 (2.1%,N=2 400) (χ2=106.67,df=1,P<0.05)。在5種檢測的貝類宿主中除福建牡蠣外，均檢測到派琴蟲感染，其中香港牡蠣的總感染率為23.64% (N=960)，顯著高于其他種類；在感染的貝類宿主中，香港牡蠣、雜色鮑感染2種派琴蟲，而馬氏珍珠貝、華貴櫛孔扇貝僅感染一種派琴蟲，即奧爾森派琴蟲；在香港牡蠣感染中，北海派琴蟲感染率為22.29% (N=960)，為優(yōu)勢感染種，顯著高于奧爾森派琴蟲 (1.35%,N=960) (χ2=199.84,df=1,P<0.05)。雜色鮑中的2種派琴蟲的感染率均較低，北海派琴蟲和奧爾森派琴蟲感染率分別為0.42% (N=480) 和 3.13% (N=480) (圖3、圖4-a)。

圖3 廣東沿海不同時間、貝類宿主、地點感染派琴蟲的分布情況Fig.3 Distribution of Perkinsus spp.at different time, in different shellfish host and different location along coastal area of Guangdong Province

圖4 廣東沿海不同貝類宿主 (a)、不同地點 (b)、不同時間 (c) 派琴蟲的總感染率變化情況Fig.4 Prevalence of Perkinsus spp.in different shellfish host (a), different location (b) and different month (c) along coastal area of Guangdong Province

2.2 派琴蟲感染空間多樣性

所有監(jiān)測地點均發(fā)現(xiàn)派琴蟲感染，總感染率由高至低分別為陽江 (45%,N=240)、江門 (28.34%,N=240)、湛江 (7.08%,N=720)、汕尾 (5.83%,N=240)、揭陽 (2.92%,N=240)、汕頭 (2.64%,N=720) (圖3、圖4-b)；其中陽江和江門為主要感染地區(qū)，顯著高于其他4個區(qū)域；湛江和陽江感染了2種派琴蟲，其中陽江地區(qū)北海派琴蟲的感染率為41.25% (N=240)，顯著高于奧爾森派琴蟲 (χ2=94.64,df=1,P<0.05, 圖4-b)；汕尾僅感染了北海派琴蟲，而揭陽僅發(fā)現(xiàn)奧爾森派琴蟲感染。粵西地區(qū)的派琴蟲總感染率為17.17% (N=1 200)，顯著高于粵東地區(qū) (3.33%,N=1 200) (χ2=123.31,df=1,P<0.05)。

2.3 派琴蟲感染時間多樣性

在所有調查月份中均發(fā)現(xiàn)派琴蟲感染，其中8和10月的感染率最高，顯著高于其他月份，12和2月感染率最低，顯著低于其他月份 (圖4-c)；除10、12月僅感染1種派琴蟲外 (P.beihaiensis)，其他月份均感染2種派琴蟲 (P.beihaiensis和P.olseni)；從季節(jié)上看，夏秋季的感染率較高，為15.67% (N=1 200)，顯著高于冬春季 (4.83%,N=1 200) (χ2=75.37,df=1,P<0.05)。

3 討論

大多數(shù)派琴蟲具有廣泛寄生特性，寄生特異性低，能夠在不同貝類寄主中廣泛傳播，因此具有全球廣泛分布的特點[19-21]。如被OIE 列入軟體動物疫病名錄的奧爾森派琴蟲，廣泛分布于亞洲、美洲、歐洲、澳洲等世界各主要貝類養(yǎng)殖海區(qū)的17個國家，寄生于隸屬5個目、6個科的多達26種貝類寄主中[22]。本研究中除福建牡蠣未發(fā)現(xiàn)感染外，其他4種貝類均感染了至少1種派琴蟲，說明派琴蟲與廣西沿海貝類感染派琴蟲的廣泛性相似[23]，在廣東沿海主要養(yǎng)殖區(qū)的貝類品種已經(jīng)普遍攜帶派琴蟲病原。

中國華南沿海貝類在較長時間里僅檢測到北海派琴蟲感染[24]，但近年來該海域派琴蟲的感染種類呈現(xiàn)多樣化，研究表明已有3種派琴蟲在華南沿海被檢測到[16]，其中奧爾森派琴蟲和切薩皮克派琴蟲 (P.chesapeaki) 均為強致病性貝類病原，曾造成世界各地貝類大規(guī)模死亡[25-26]。本研究亦監(jiān)測到北海派琴蟲和奧爾森派琴蟲這2種派琴蟲的感染，尤其在一些重要養(yǎng)殖種類如香港牡蠣中，其感染率偏高，說明這2種派琴蟲已經(jīng)在廣東沿海環(huán)境中較穩(wěn)定地共存。2018—2019年冬春季期間，廣東江門、惠州、揭陽一帶發(fā)生香港牡蠣大規(guī)模死亡，檢測發(fā)現(xiàn)派琴蟲感染率高，雖無直接證據(jù)證明死亡是派琴蟲直接導致，但是從派琴蟲的巨大危害性看，香港牡蠣的生存狀態(tài)必然受到一定影響。

派琴蟲感染與貝類的攝食方式、養(yǎng)殖區(qū)域、養(yǎng)殖方式具有很強的相關性[27]。本研究中雜色鮑的派琴蟲感染率非常低，與其工廠化養(yǎng)殖、接觸外海環(huán)境少、舐食性飼料避免派琴蟲污染等因素密切相關。而香港牡蠣主要在河口區(qū)養(yǎng)殖，受人類活動影響強烈，且南方降雨量大，淡水大量的注入經(jīng)常引起鹽度和溫度的大幅波動，這些變化是導致派琴蟲活力、感染力增強的核心要素，是派琴蟲感染率高的主要原因[27-28]。香港牡蠣的養(yǎng)殖方式也對派琴蟲感染具有一定程度的影響，如陽江采樣點采用的是圍塭養(yǎng)殖，水體交換主要通過潮水漲落、控制水閘來完成，其派琴蟲感染率與圍塭外水域的派琴蟲含量密切相關。本研究中陽江地區(qū)的感染率最高，可能由圍塭外水域的派琴蟲濃度較高引起。而揭陽地區(qū)香港牡蠣主要以池塘養(yǎng)殖為主，屬于更小水體養(yǎng)殖，各池塘間通過共同的水溝進行水體交換，其可控性比圍塭養(yǎng)殖更強，從檢測結果也發(fā)現(xiàn)派琴蟲的感染率低得多。

派琴蟲感染種類多樣性呈現(xiàn)較強的區(qū)域性和貝類寄主特異性。本研究發(fā)現(xiàn)廣東沿海貝類感染優(yōu)勢種為北海派琴蟲，而奧爾森派琴蟲感染率較低。但廣東湛江吳川水域的尖紫蛤卻與本研究結果相反，即奧爾森派琴蟲的感染率顯著高于北海派琴蟲[15]。廣西沿海貝類感染派琴蟲的情況更復雜，不同的貝類種類呈現(xiàn)出不同的派琴蟲多樣性感染規(guī)律，如香港牡蠣中北海派琴蟲的感染率顯著高于奧爾森派琴蟲，而菲律賓蛤仔中奧爾森派琴蟲的感染率顯著高于北海派琴蟲[23]。造成派琴蟲感染規(guī)律迥異的首要原因可能是派琴蟲對不同海區(qū)條件的適應性，導致海水中派琴蟲豐度的差異，從而引起感染率差異。其次是派琴蟲對貝類寄主的偏好性，貝類寄主的濾食方式[29]和養(yǎng)殖方式[26]的差異也可影響派琴蟲感染成功率。貝類不同生長階段頻繁的變換海區(qū)也是導致派琴蟲傳染、生物多樣性復雜化的重要原因之一。如幼貝期香港牡蠣一般在環(huán)境條件優(yōu)越、污染少的海區(qū)養(yǎng)殖，如廣西欽州、廣東珠海三灶、廣東揭陽等地；但是，隨著貝類攝食量的增加，待到中蠔期，貝民們普遍做法是將其運往藻類食物豐度高的海區(qū)進行育肥，如廣東陽江、江門、惠州、廣西北海等地。這種養(yǎng)殖海區(qū)更換的副作用就是促進了派琴蟲在各個海區(qū)之間傳播，從而大大增加了派琴蟲感染的廣度和復雜性。

不同海域中，貝類派琴蟲的季節(jié)動態(tài)呈現(xiàn)不同趨勢。廣西沿海香港牡蠣派琴蟲維持較高感染率，各個季節(jié)香港牡蠣感染率均在23.75%以上，夏秋季感染率 (44.8%) 略高于冬春季 (37.7%)，但無顯著差異[23]。對廣東湛江地區(qū)尖紫蛤季節(jié)動態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，冬春季的派琴蟲感染率顯著高于夏秋季[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)，貝類在夏秋季的派琴蟲感染率顯著高于冬春季。導致這種差異的最可能原因是調查海域和貝類寄主的差異。廣西沿海地處北部灣海域，屬于半封閉海灣，其水文地理環(huán)境可能較適合派琴蟲生長和發(fā)育。廣西沿海和廣東湛江地區(qū)調查的寄主分別為香港牡蠣和尖紫蛤，都具體到單個品種的季節(jié)動態(tài)監(jiān)測，其派琴蟲的季節(jié)動態(tài)勢必會受到寄主的養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖方式、攝食方式、棲居方式、養(yǎng)殖密度等因素的綜合影響，因此其季節(jié)動態(tài)會具有較強的獨特性。如尖紫蛤是一種獨特的生活于河口區(qū)的掘洞棲息型貝類，主要分布于湛江吳川河口地區(qū)，能適應低至零度的海水[30]，與香港牡蠣的生活環(huán)境差異巨大，因此也導致派琴蟲感染趨勢的差異。本研究將季節(jié)動態(tài)調查的種類擴大到5種主要養(yǎng)殖貝類，并且增加了采樣時間頻次 (每年采樣8次)，因此派琴蟲的季節(jié)動態(tài)結果更貼近現(xiàn)實、更具代表性。鑒于兩廣地區(qū)貝類養(yǎng)殖的高互通性以及廣西地區(qū)派琴蟲感染的普遍性，廣東地區(qū)的派琴蟲病原極有可能通過接納來自廣西的香港牡蠣中蠔育肥而擴大了感染率和感染豐度，因此很有必要在貝類異地運輸前進行派琴蟲病的檢驗檢疫工作，從而切斷派琴蟲在貝類的傳染途徑。