仇玉燕，張志勇，陳淑吟，倪可雯，賈超峰，孟 乾，祝 斐，張志偉，湯曉建

1.上海海洋大學(xué)/水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 ，上海 201306

2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007

投喂頻率對養(yǎng)殖魚類的生長、發(fā)育有顯著影響[1-2]。適宜的投喂頻率可以最大程度地促進(jìn)魚體生長、降低個體分化差異、提高餌料利用率等[3-4]；反之則會對魚類生長、代謝造成危害，由于關(guān)系到養(yǎng)殖效益及生態(tài)環(huán)境，對集約化魚類養(yǎng)殖的影響尤為明顯[5-6]；探究所飼魚種的最優(yōu)投喂頻率關(guān)系到集約化養(yǎng)殖的成敗。不同魚類的最適投喂頻率不同；每天3次的飽食投喂頻率就可滿足11～60 g的牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 的最大生長性能[7]；而1～16 g的鋸蓋魚 (Centropomus undecimalis) 幼魚的最適投喂頻率是每天4～6次[8]。最適投喂頻率的確定還受到魚體年齡、大小的影響，如點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus coioides) 個體規(guī)格越大，生長階段越靠后，其最適宜投喂頻率越低[9]。

大量研究表明，投喂頻率與魚體的生長發(fā)育[10-14]、消化代謝[15-19]和免疫應(yīng)激[20-23]等顯著相關(guān)。如投喂頻率采用 1 次·2 d?1和 1 次·3 d?1的大西洋鮭(Salmo salar) 魚體質(zhì)量增加率較 3 次·d?1的分別降低了50%和75%[10]；(35.5±4.58) g的珍珠龍膽石斑魚 (E.fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂) 幼魚以2次·d?1投喂的增重率和特定生長率顯著高于1 次·d?1的[11]；(55.25±0.61) g 彭澤鯽 (Carassius auratusvarpengze) 幼魚以 3 次·d?1投喂的增重率、特定生長率和肥滿度等生長指標(biāo)較1次·d?1的顯著升高了47%、37%和6.5%[12]。15 g的紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes) 幼魚以 3 次·d?1投喂的消化酶活性顯著高于 2 次·d?1和 4 次·d?1的[17]；(0.57±0.01) g的厚頜魴 (Megalobrama pellegrini) 幼魚以 3 次·d?1投喂的腸消化酶活性顯著高于2次·d?1的[18]；(88.3±2.4) g金頭鯛投喂頻率超過1次·d?1時其胃蛋白酶活力顯著下降[19]。(12.29±0.40) g的青魚 (Mylopharyngodon piceus) 幼魚以 3 次·d?1投喂時，其體脂肪含量與抗氧化酶活力顯著升高[20]；(0.5±0.04) g的黃顙魚幼魚投喂頻率從 1次·d?1升至 4次·d?1時，其肝臟超氧化物歧化酶和過氧化氫酶mRNA的表達(dá)量顯著升高[21]；投喂頻率為4次·d?1時，(4.14±0.74) g的長鰭籃子魚 (Siganus canaliculatus) 幼魚的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著升高[22]。因此，了解主要養(yǎng)殖魚類的最適投喂頻率及其生理響應(yīng)情況，有助于開展持續(xù)、高效的養(yǎng)殖工作[2,4]。

黑鯛 (Acanthopagrus schlegelii, ♀)×真鯛 (Pagrus major, ♂)的雜交F1在生長方面有優(yōu)于黑鯛的表現(xiàn)[24-26]；以雜交F1為親本，獲得的雜交F2(暫定名為“雜交鯛”)，在早期發(fā)育階段亦表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢[27]；筆者有關(guān)雜交鯛與黑鯛生長相關(guān)基因的檢測也得到了相似的結(jié)果 (另文發(fā)表)。目前尚未見雜交鯛與黑鯛幼魚在不同投喂頻率下生長、生理等方面的差異研究報道。本研究以黑鯛 (♀)×真鯛 (♂) 雜交F2和黑鯛幼魚為研究對象，探討比較了雜交鯛和黑鯛幼魚在不同投喂頻率下的生長性能、生理生化指標(biāo)的差異表現(xiàn)，以期在改善生長性能的同時提高飼料利用率，為雜交鯛的投喂管理和新品種培育技術(shù)的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚來源及規(guī)格

實(shí)驗(yàn)在江蘇省南通市海水種苗繁育及增養(yǎng)殖技術(shù)中心進(jìn)行。選擇相同規(guī)格的健康個體作為樣本，雜交 F2體質(zhì)量 (6.42±0.14) g，體長 (5.70±0.11) cm；黑鯛體質(zhì)量 (6.52±0.23) g，體長 (5.86±0.14) cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)4 m×3.2 m×3.2 m水泥池中進(jìn)行。設(shè)置 4 個投喂頻率組 (1T：1 次·d?1、2T：2 次·d?1、3T：3 次·d?1、4T：4 次·d?1) 。投喂時間設(shè)置為 1T組18:00，2T組 7:00、18:00，3T組 7:00、11:00、18:00 ，4T 組 7:00、11:00、15:00、18:00。采用定制的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥40.0%的海水魚配合飼料。根據(jù)魚體規(guī)格調(diào)整飼料粒徑大小，前期投喂定制海水魚1號配合飼料，后期改喂定制海水魚2號配合飼料。飽食投喂，記錄投喂量，每次持續(xù)投喂約40 min，而后回收并記錄殘餌量。

正式實(shí)驗(yàn)前，將實(shí)驗(yàn)魚先暫養(yǎng)適應(yīng)1周。同一投喂頻率的兩種魚飼養(yǎng)于同一水泥池的不同網(wǎng)箱內(nèi)，網(wǎng)箱尺寸為1 m×1 m×1.2 m，3個網(wǎng)箱并排為一組，即每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個重復(fù)，2種魚的放養(yǎng)密度均為每個網(wǎng)箱60尾。各實(shí)驗(yàn)組投喂管理一致，實(shí)驗(yàn)周期40 d。實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄死亡魚尾數(shù)。

實(shí)驗(yàn)期間水質(zhì)因子采用在線探頭監(jiān)測，水溫22～29 ℃，pH 7.5～8.2，鹽度29～30，氨氮質(zhì)量濃度<0.2 mg·L?1。24 h持續(xù)充氣，水中溶解氧質(zhì)量濃度>6.0 mg·L?1。每天換水1次，日換水量超過50%，自然光照。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

分別在養(yǎng)殖的第0 (實(shí)驗(yàn)開始)、第15、第30和第40天 (實(shí)驗(yàn)結(jié)束) 從每個網(wǎng)箱中隨機(jī)取樣6尾(N=6) 進(jìn)行體長、體質(zhì)量測量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束 (第40天時)，實(shí)驗(yàn)魚停止投喂24 h后開始采樣。采樣時，隨機(jī)從每個網(wǎng)箱里取6尾魚，快速解剖，取胃、肝臟等組織速凍于液氮中，后轉(zhuǎn)移到?80 ℃冰箱冷凍保存。

1.3.1 生長指標(biāo)測定

投喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)雜交F2和黑鯛的體長、終末體質(zhì)量 (Final body mass, FBM)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)魚的增重率 (Weight gain rate, WGR)、特定生長率(Special growth rate, SGR) 和肥滿度 (Condition fact,CF)；解剖后稱取肝臟和內(nèi)臟質(zhì)量，計(jì)算肝體指數(shù)(Hepatosomatic index, HSI)、臟體指數(shù) (Viscera somatic index, VSI)；65 ℃烘干每次投喂結(jié)束后回收的殘餌，稱質(zhì)量以計(jì)算攝食量 (Food intake, FI) 與飼料系數(shù) (Feed conversion ratio, FCR)，測定殘餌溶失率，校正攝食量 (稱取與投喂量相同質(zhì)量的餌料，40 min后收集，65 ℃ 干燥，稱量并計(jì)算溶失率)；清算每個實(shí)驗(yàn)組的存活魚尾數(shù)，計(jì)算成活率(Survival rate, SR)；以體質(zhì)量樣本標(biāo)準(zhǔn)差和樣本平均數(shù)之比計(jì)算體質(zhì)量變異系數(shù) (Coefficient of variation, CV)。公式如下：

式中：Wt為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時的體質(zhì)量 (g)；W0為實(shí)驗(yàn)開始的體質(zhì)量 (g)；t為實(shí)驗(yàn)天數(shù) (d)；Wh為肝臟質(zhì)量；Wv為內(nèi)臟質(zhì)量；L為體長 (cm)；Nt為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時魚尾數(shù) (尾)；N0為實(shí)驗(yàn)開始時魚尾數(shù)(尾)；SD為體質(zhì)量樣本標(biāo)準(zhǔn)差；X為體質(zhì)量樣本平均數(shù)；F為攝食量 (g)。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測定

取胃、肝臟組織測定消化酶及抗氧化酶活力。胃蛋白酶 (Pepsin)、脂肪酶 (Lipase, LPS)、α-淀粉酶 (α-Amylase, AMS)、總超氧化物歧化酶 (TSOD)、過氧化氫酶 (CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛 (MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST) 及堿性磷酸酶 (AKP) 活力均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行測定，測定方法參照說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019和SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (±SE)”表示，差異顯著 (P<0.05) 時，再采用Duncan's 法進(jìn)行組間差異的多重比較。

2 結(jié)果

2.1 雜交鯛與黑鯛的生長性能和形態(tài)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時測得雜交F2和黑鯛的生長、形態(tài)與生理指標(biāo) (表1)。投喂頻率從1T升至2T時，雜交F2與黑鯛的FBW、WGR、SGR、HSI及SR等指標(biāo)顯著升高 (P<0.05)；投喂頻率超過2T，兩種魚的F B W、W G R、S G R、S R無顯著差異(P>0.05)，HSI、VSI顯著降低 (P<0.05)。投喂頻率對兩種魚的CF、CV、FI和FCR無顯著影響 (P>0.05)。由此可得出，2T的飽食投喂頻率無論對雜交F2還是黑鯛均可獲得較好的養(yǎng)殖效果。

表1 不同投喂頻率下雜交鯛與黑鯛生長性能和形態(tài)指標(biāo)的變化差異Table 1 Difference of growth performance and morphological indexes of hybrid porgy of A.schlegelii ♀× P.major♂ and A.schlegelii with different feeding frequencies

相同投喂頻率下，雜交F2在1T—3T組的FBW、WGR、SGR等指標(biāo)均顯著高于黑鯛 (P<0.05)。雜交F2在3T組中的CF、VSI和1T組中的HSI均顯著高于黑鯛 (P<0.05)。雜交F2的飼料系數(shù)也有相對優(yōu)于黑鯛的表現(xiàn)，其中2T組雜交F2的FCR為0.83±0.11，黑鯛為1.39±0.47。雜交F2的CV也優(yōu)于黑鯛；相同頻率下2種實(shí)驗(yàn)魚的SR、FI等均無顯著差異 (P>0.05)。

2.2 雜交鯛與黑鯛消化酶活力變化

投喂頻率從1T升至2T時，雜交F2與黑鯛的胃蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶等消化酶活力顯著升高 (P<0.05)；投喂頻率超過2T，2種魚的消化酶活力無顯著變化 (P>0.05)。雜交F2在2T—4T組內(nèi)的胃蛋白酶和2T組內(nèi)的脂肪酶活力均顯著高于黑鯛(P<0.05)，但2種魚的α-淀粉酶活力無顯著差異(P>0.05，圖1)。

圖1 不同投喂頻率下雜交鯛與黑鯛消化酶活力比較Fig.1 Comparison of digestive enzyme activities of hybrid porgy of A.schlegelii ♀× P.major♂ and A.schlegelii with different feeding frequencies

2.3 雜交鯛與黑鯛肝臟抗氧化指標(biāo)變化

當(dāng)投喂頻率從1T升至3T時，雜交F2的 CAT、T-SOD活力顯著增加 (P<0.05)，GSH-Px活力無顯著變化 (P>0.05)；繼續(xù)升高投喂頻率至4T時，雜交F2的GSH-Px、CAT、T-SOD活力均顯著下降 (P<0.05)；但雜交F2的MDA活力不受投喂頻率的影響。相同的投喂頻率下，兩種魚的GSH-Px、MDA活力均無顯著差異 (P>0.05)；而4T組內(nèi)雜交F2的CAT、T-SOD活力顯著高于黑鯛 (P<0.05，圖2)。

圖2 不同投喂頻率下雜交鯛與黑鯛肝臟抗氧化指標(biāo)比較Fig.2 Comparison of liver antioxidant indexes of hybrid porgy of A.schlegelii ♀× P.major♂ and A.schlegelii with different feeding frequencies

2.4 雜交鯛與黑鯛肝功能指標(biāo)變化

4種不同投喂頻率下，雜交F2與黑鯛的ALT、AST和AKP等主要肝功能指標(biāo)均無顯著變化(P>0.05)。且在同一投喂頻率下，雜交F2與黑鯛的肝功能指標(biāo)也無顯著性差異(P>0.05，圖3)。

圖3 不同投喂頻率下雜交鯛與黑鯛肝功能指標(biāo)比較Fig.3 Comparison of liver function indexes of hybrid porgy ofA.schlegelii ♀×P.major♂ and A.schlegelii with different feeding frequencies

3 討論

3.1 生長與飼養(yǎng)效果分析

投喂與攝食直接關(guān)系到魚類的生長與代謝。WGR和SGR為反映魚類生長效果的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，雜交F2與黑鯛的生長性能等主要指標(biāo)，在投喂頻率從1T升至2T時顯著升高，在投喂頻率大于2T時不再升高并趨于穩(wěn)定，表明兩種魚2次·d?1的投喂頻率可以得到相對較好的養(yǎng)殖效果。對雜交魴 (M.terminalis♀×Erythroculter ilishaeformis♂)[28]、卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus)[29]、鯔魚 (Mugil liza)[30]及許氏平鲉 (Sebastes schlegeli) 幼魚[31]的投喂頻率研究也得出，在一定范圍內(nèi)升高投喂頻率，魚類的生長性能隨之增加，繼續(xù)升高投喂頻率，其生長性能不再增加并逐漸趨于穩(wěn)定。然而，在90～120 d內(nèi)大口黑鱸 (Micropterus salmoides) 在2T組的WGR和SGR顯著優(yōu)于其他高投喂頻率組[32]。這可能是因?yàn)檫^高的投喂頻率導(dǎo)致喂食間隔變短，胃腸中的飼料還未排空又?jǐn)z入了新的食物，使得胃排空率加快，腸胃負(fù)荷加大，進(jìn)而影響食物中營養(yǎng)的充分吸收。此外，在本實(shí)驗(yàn)4個投喂頻率組中，雜交F2的FBW、WGR、SGR均高于黑鯛，且在1T—3T組有顯著差異；同樣的飽食投喂2T，雜交F2的WGR (552.13±11.25)和SGR(4.67±0.32) 分別比黑鯛高 60% (344.48±47.69)和25% (3.72±0.26) 以上，表明雜交F2具有比親本黑鯛更好的生長優(yōu)勢。

HSI、VSI可以衡量魚體的能量狀態(tài)[33]。本實(shí)驗(yàn)中，投喂頻率超過2 T時，雜交F2與黑鯛的HSI、VSI均顯著降低，說明超過一定范圍后，繼續(xù)升高投喂頻率，魚體的營養(yǎng)和能量積累并不會隨之增大，甚至還會受到負(fù)面影響。對鯉 (Cyprinus carpio)[34]、黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco)[35]的研究也得出了類似結(jié)論。但對花羔紅點(diǎn)鮭 (Salvelinus malma)[36]、大口黑鱸 (Micropterus salmoides)[32]和花鱸 (Lateolabrax maculatus) 幼魚[37]的研究發(fā)現(xiàn)，升高投喂頻率，HSI或VSI也隨之增加。這可能與投喂頻率升高使得魚體的能量狀態(tài)得到改善有關(guān)。而升高投喂頻率，瓦氏黃顙魚 (P.vachelli) 幼魚的HSI卻無顯著變化[38]。另一方面，雜交F2在1T組的HSI、3T組的VSI顯著高于黑鯛，這可能與雜交F2攝食與生長速度高于黑鯛有關(guān)，因此其肝臟等內(nèi)臟中積累的脂肪較多，造成了肝體比、臟體比增大。

本實(shí)驗(yàn)中，投喂頻率頻從1T升至2T時，雜交F2和黑鯛的成活率顯著增加；繼續(xù)升高投喂頻率，兩種實(shí)驗(yàn)魚的成活率無顯著變化，其原因可能是1T的投喂頻率不能夠滿足雜交F2和黑鯛生存和生長所需的食物供給，饑餓脅迫使得魚體間搶食、自相殘殺的概率加大，成活率降低。這種現(xiàn)象在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。另外，投喂頻率對兩種魚的CF、CV和FCR均無顯著影響。這與雜交鱘(Acipenser schrenckiiBrandt♀×A.baeriBrandt♂) 的研究結(jié)論一致[39]，卻與大黃魚 (Larimichthys crocea)的結(jié)果不同[40]，這些不同的結(jié)果可能受到魚的食性及養(yǎng)殖環(huán)境等的影響。而在相同投喂頻率下，雜交F2的FCR與CV相對優(yōu)于黑鯛，表明雜交F2的飼料利用率相對較高，個體差異相對較小，具有較好的品種優(yōu)勢潛力。

3.2 消化能力分析

消化酶活力反映了魚類的消化能力，投喂頻率的改變會引起魚類消化酶活力的變化[41-42]。本研究通過分析胃蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶等消化酶發(fā)現(xiàn)，低于2T的投喂頻率顯著影響了雜交F2和黑鯛的消化酶活力，2種魚1T組的消化酶活力顯著高于其他3組，且這3組間無顯著差異。結(jié)合生長性能的變化趨勢，說明在投喂頻率較低、食物較少時，魚體會提高其自身消化能力，達(dá)到充分吸收和利用食物的目的，降低因營養(yǎng)攝入不足所帶來的生長差異；而在投喂頻率較高、食物充足時，其消化酶活力僅維持在正常甚至較低水平便可滿足生長和代謝所需[43]。這與許氏平鲉幼魚[31]、黃斑籃子魚(S.oramin) 幼魚[44]的研究結(jié)果相似。因此，在飽食狀態(tài)下，2T的投喂頻率完全可以滿足實(shí)驗(yàn)魚的正常生長代謝所需。另外，與黑鯛相比，2T組雜交F2的胃蛋白酶、脂肪酶活力均有顯著高表達(dá)，說明雜交F2的消化吸收營養(yǎng)能力較強(qiáng)，且與個體生長速度較快有關(guān)。

3.3 肝臟抗氧化能力與肝臟健康

魚體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧 (Reactive oxygen species,ROS) 未及時清除時，會使組織和機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷[45]。SOD 主要催化超氧陰離子 (·O?2) 生成過氧化氫 (H2O2)，CAT、GSH-Px主要催化機(jī)體內(nèi)的H2O2分解成CO2和H2O[32,46]，MDA為SOD過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物[36]。對于雜交F2與黑鯛，CAT、T-SOD和GSH-Px活力隨著投喂頻率的增加呈先升高后降低的趨勢，這表明機(jī)體在應(yīng)激反應(yīng)后通過自身的調(diào)節(jié)恢復(fù)平衡，未對機(jī)體造成不可逆損傷。這與卵形鯧鲹[47]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。不同的是，在大口黑鱸[25]中，隨著投喂頻率的升高CAT和T-SOD活力顯著降低；而在花羔紅點(diǎn)鮭[36]、異育銀鯽 (C.auratus gibelio)[42]、大黃魚[48]中，升高或降低投喂頻率，CAT、SOD和GSH-Px活力不發(fā)生改變。此外，結(jié)合生長性能分析，在適宜的范圍內(nèi)升高投喂頻率，抗氧化能力會維持在一個較高且相對穩(wěn)定的狀態(tài)，對生長有促進(jìn)作用；超出此范圍后，過低或過高的投喂頻率均會使抗氧化能力顯著降低，對生長產(chǎn)生抑制作用[46,49]。本實(shí)驗(yàn)中，2種魚MDA活力不受投喂頻率的影響。許多研究得出了類似結(jié)論[9-10,32]，但升高投喂頻率，團(tuán)頭魴 (M.amblycephala) MDA活力顯著增加[50]。在4 T組，雜交F2的CAT、T-SOD活力顯著高于黑鯛，說明雜交F2的抗氧化能力更強(qiáng)。一般認(rèn)為，當(dāng)肝臟病變或受損時，AST和ALT活力升高[51-52]。本實(shí)驗(yàn)中，增加投喂頻率，雜交F2和黑鯛的肝臟ALT、AST和AKP活力無顯著變化，表明本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的投喂頻率未對2種魚的肝臟造成嚴(yán)重且不可逆損傷。

4 結(jié)論

綜上所述，不同投喂頻率可顯著影響雜交鯛與黑鯛幼魚的生長性能和生理生化指標(biāo)；在投喂頻率為2T時，2種魚生長快、飼料利用率高、抗氧化能力強(qiáng)。雜交鯛在所有組別中的生長性能及多個生理生化指標(biāo)均優(yōu)于黑鯛。