嚴(yán) 利，黃賽玉

（湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床學(xué)院，湖南 湘潭 411101）

凋亡（apoptosis）是缺血后神經(jīng)元死亡的一種重要形式，凋亡信號(hào)途徑包括外源性途徑、內(nèi)源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑[1，2]，其中前二者為經(jīng)典凋亡途徑，ERS 為近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑[3]。毒胡蘿卜素（Thapsigargin，TG）是一種不可逆性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP 酶抑制劑，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而應(yīng)激的持續(xù)存在將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。目前，腦缺血后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生機(jī)制尚未明確，仍有待進(jìn)一步研究。本研究主要探討毒胡蘿卜素誘導(dǎo)大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞的凋亡機(jī)制，以期為缺血后神經(jīng)元凋亡的防治提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；1640 培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清和胰酶消化液（Gibco），青-鏈霉素溶液（碧云天），Thapsigargin 和MTT（Sigma），JNK3 和GM130（Proteintech），Caspase-3（CST），Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡（長沙維爾生物有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（Wellbio），HRP goat anti-mouse IgG（Proteintech），HRP goat anti-rabbit IgG（Proteintech），Super ECL Plus 超敏發(fā)光液（Thermo pierce），顯影液和定影液（WellBiology）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC12 細(xì)胞在含10%的胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)裝置為5%CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱，隔天換液，取細(xì)胞形態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物濃度及實(shí)驗(yàn)分組 1 mg 裝的Thapsigargin 溶于1 ml DMSO 溶液中，儲(chǔ)液濃度為1 mg/ml。取1 μl加入到10 ml 完全培養(yǎng)基中，終濃度為0.1 μg/ml。PC12 細(xì)胞分別經(jīng)正常情況下培養(yǎng)5 h（正常組）和加入濃度為0.1 μg/ml的Thapsigargin 處理5 h（Thapsigargin 組）進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1 MTT 法檢測(cè) 兩組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，處理5 h 后，每孔加入25 μl 溶解于DMEM的MTT 溶液（5 mg/ml），在培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO 溶液，37 ℃搖床低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在490 nm 處的吸光度（A）值，計(jì)算出PC12 細(xì)胞的存活率。

1.4.2 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè) PC12 細(xì)胞凋亡率嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號(hào)：KGA108）的說明書檢測(cè)PC12 細(xì)胞凋亡率。用不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，以冰冷的PBS 洗滌2 次，離心（2000 rpm/min，5 min）后收集細(xì)胞，收集（1～5）×105細(xì)胞。除去上清液，滴入500 μl Binding buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI 使用液使其混勻，置于室溫下避光5～15 min 后，1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.4.3 Western blot 蛋白印跡法檢測(cè) 收集兩組PC12細(xì)胞，提取總蛋白，使用蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，按每孔上樣量50 μg 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，恒流冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，抗JNK3（1∶500）、Caspase-3（1∶1000）和β-actin（1∶4000），4 ℃孵育過夜。用TBST 洗3 次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，TBST 漂洗4 次，ECL 顯影和采圖。β-actin 為內(nèi)參，利用Quantity one 軟件將目標(biāo)條帶與β-actin 條帶吸光度值之比調(diào)為其蛋白表達(dá)水平的相對(duì)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC12 細(xì)胞的形態(tài)觀察 PC12 細(xì)胞的形態(tài)呈圓形或錐形，貼壁不穩(wěn)，易成團(tuán)，胞間有突起相互連接，細(xì)胞折光性好，可見胞核，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后生長速度快，成簇生長，見圖1。

圖1 顯微鏡觀察正常培養(yǎng)條件下PC12 細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)（10×40）

2.2 Thapsigargin 對(duì)PC12 細(xì)胞存活率的影響 經(jīng)0.1 μg/ml Thapsigargin 處理5 h的PC12 細(xì)胞存活率較正常培養(yǎng)的細(xì)胞明顯減少。Thapsigargin 組吸光度A 值為（0.1497±0.0357），低于正常組的（0.2573±0.0093），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.0490，P=0.0070）。

2.3 Thapsigargin 對(duì)PC12 細(xì)胞凋亡率的影響 正常組PC12 細(xì)胞絕大部分均為雙陰性細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無明顯細(xì)胞凋亡或死亡，而經(jīng)Thapsigargin 處理后PC12 細(xì)胞的凋亡率明顯增加，見圖2。Thapsigargin 組早期凋亡率及總凋亡率高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組PC12 細(xì)胞凋亡率比較（，%）

表1 兩組PC12 細(xì)胞凋亡率比較（，%）

圖2 AnnexinV-FITC/PI 法檢測(cè)PC12 細(xì)胞的凋亡率流式細(xì)胞分析圖

2.4 Thapsigargin 對(duì)PC12 細(xì)胞JNK3、Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 Thapsigargin 組JNK3、Caspase-3 蛋白表達(dá)高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組JNK3、Caspase-3 蛋白表達(dá)比較（）

表2 兩組JNK3、Caspase-3 蛋白表達(dá)比較（）

3 討論

隨著人口老齡化的加劇及卒中危險(xiǎn)因素的不斷增多，腦卒中發(fā)病率逐年上升。腦卒中作為神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，具有高復(fù)發(fā)率、高致死率、高致殘率的特點(diǎn)，目前已經(jīng)成為全世界成人中第2 死亡原因和第1 致殘?jiān)騕5，6]，其存活者中有50%～70%的患者會(huì)遺留嚴(yán)重殘疾，給家庭和社會(huì)帶來巨大的壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。卒中類型以缺血性卒中最常見，約占全部卒中類型的80%。腦缺血是由于血栓或栓子阻塞腦內(nèi)動(dòng)脈而導(dǎo)致血管閉塞，引起腦組織缺血缺氧、神經(jīng)元受損的一系列臨床癥狀和體征[8]。缺血后神經(jīng)元的凋亡發(fā)生是一種多環(huán)節(jié)調(diào)控過程，包括興奮氨基酸的釋放、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、熱休克蛋白表達(dá)受阻及血腦屏障破壞等過程[9，10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)器越來越受到重視。研究表明[11]，Thapsigargin 可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵功能，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲(chǔ)藏鈣的釋放，增加胞質(zhì)中Ca2+濃度，導(dǎo)致Ca2+環(huán)境失衡，引起神經(jīng)元凋亡。本研究中利用Thapsigargin誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞，建立缺血后神經(jīng)元損傷模型，通過MTT 法檢測(cè)存活率和Annexin V-FITC/PI 法檢測(cè)凋亡率，結(jié)果顯示Thapsigargin 組早期凋亡率及總凋亡率高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示經(jīng)Thapsigargin 組處理后PC12 細(xì)胞的存活率較正常組明顯減少，凋亡率較正常組明顯增加。

JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族中的重要成員，主要參與細(xì)胞存活與凋亡、增殖與分化等多個(gè)生物學(xué)過程。JNK 主要包括JNK1、JNK2、JNK3 3 個(gè)成員，其中JNK3 是JNK 信號(hào)通路中非常重要的異構(gòu)體之一，主要分布在中樞神經(jīng)腦組織中，與神經(jīng)元的凋亡關(guān)系密切[12，13]。大量的炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、應(yīng)激可以激活JNK3及其后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，有研究表明[14]，帕金森病患者中JNK3 磷酸化可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。此外，JNK3 可介導(dǎo)百草枯和魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡[15]。JNK3 還可啟動(dòng)Bcl-2、Caspase-3 等信號(hào)，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[16]。半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）為細(xì)胞凋亡途徑中的重要因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中具有重要意義[17]。帕金森病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)[18]，腦細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)改變，其中有Caspase-3 被激活。Zhang Y 等[19]研究表明，在肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥動(dòng)物模型中，Caspase-1 和Caspase-3 被激活，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Caspase-1 和Caspase-3的mRNA 表達(dá)水平明顯增加。王麗晶等[20]在腦卒中相關(guān)性肌萎縮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，抑制Caspase-3 通路激活，可抑制肌細(xì)胞凋亡，增加肌纖維橫截面積，對(duì)抗腦卒中相關(guān)性肌萎縮。本研究中Thapsigargin 組JNK3、Caspase-3 蛋白表達(dá)高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示JNK3、Caspase-3 可能參與了神經(jīng)細(xì)胞損傷過程。Caspase-3 作為腦缺血損傷中發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵酶以及執(zhí)行者，抑制Caspase-3的活性，可在一定程度上減緩或阻止缺血性腦卒中的進(jìn)程。

綜上所述，經(jīng)Thapsigargin 處理后PC12 細(xì)胞凋亡率增加，JNK3、Caspase-3 蛋白表達(dá)增加，推測(cè)Thapsigargin 誘導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，可通過激活JNK3及其后的信號(hào)通路，促進(jìn)Caspase-3 表達(dá)，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。