鐵明慧 呂銳萍 魏丹霞 陳維軍 郭施余 陳斌

血管內(nèi)皮功能障礙(Endothelial dysfunction,ED)是高血壓及其靶器官損害發(fā)生、發(fā)展的重要機制，也是高血壓治療方法的潛在靶向目標[1]。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)在內(nèi)皮細胞損傷中發(fā)揮著多種生物學效應，如介導氧化應激反應、激活凋亡信號通路、促進血栓形成、纖維化與血管重構等，最終參與內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生[2-4]。桑芪首烏片是云南省榮譽名中醫(yī)陸家龍教授治療高血壓病的經(jīng)驗方經(jīng)制劑工藝優(yōu)化而成的固定劑型[5]，既往研究表明：桑芪首烏片可降低自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）血漿AngⅡ水平，對RAS作用具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點的綜合影響[6]。本實驗將探討桑芪首烏片對SHR血管內(nèi)皮保護作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SPF 級SHR30 只，8 周齡，體重235～245 g；Wistar-kyoto（WKY）大鼠10 只，8 周齡，體重260～280 g。均購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號為51203500008304，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SYXK(川)2020-232。經(jīng)適應性喂養(yǎng)2 w 后進行實驗。

1.2 倫理審查本研究獲云南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準，批準編號：R-0602017G014。

1.3 藥物及試劑桑芪首烏片（專利號：ZL 2016 1 0148818.7），由桑寄生、黃芪、制首烏、鉤藤、天麻、三七等11味中藥組成[7]，中藥原材料購于云南白藥集團股份有限公司（批號：2013002134），成人（標準體重）臨床日劑量為生藥158 g，由昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制成浸膏，每克相當于生藥材5.8 g；厄貝沙坦片，規(guī)格150 mg/片（Sanofi Winthrop Industrie，國藥準字J20130049），以上藥物實驗時用0.1%DMSO 溶解成高濃度溶液后，再用純凈水稀釋成所需濃度。熒光標記鼠抗兔CD45 抗體（FITC-anti-Rat CD45，生產(chǎn)批號為204426，購自Biolegend 公司）；鼠抗兔CD31抗體（PEmouse anti-Rat CD31，生產(chǎn)批號為555027，購自BD 公司）；改良Masson 三色染色液（生產(chǎn)批號為0311A20，購自Sigma公司）。

1.4 儀器及設備BP-600A全自動大小鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（成都泰盟）；NovoCyte 流式細胞儀（美國艾森生物科學公司）；DNM-9602 酶標儀（北京普朗）；BA400Digital 三目攝像顯微鏡（廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗分組及給藥 將SHR 適應性飼養(yǎng)2 w后，測定血壓，收縮壓高于21.4 kPa（160.71 mmHg）者為合格研究對象進入實驗[8]。根據(jù)體重將30 只SHR隨機分組編號，即：桑芪首烏片組(SQ組)、厄貝沙坦片組（EB 組）和模型組，并以WKY 大鼠為正常對照組。參照藥理試驗中大鼠與人體間的等效劑量換算[9]，SQ組給予桑芪首烏片浸膏2.8 g·kg-1·d-1，EB組給予厄貝沙坦片15.625 mg·kg-1·d-1（相當于成人臨床劑量150 mg/d)，模型組、正常對照組均給予生理鹽水。給藥容量為10 mL/kg，各組每日灌胃給予相應的藥物，每周稱量體重1次，并且依據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。實驗期間各組均飼予普通飼料，并自由飲水，給藥時間為28 d。

1.5.2 大鼠血壓測量 正式測量前先進行為期5 d的測壓訓練，待大鼠適應環(huán)境、血壓穩(wěn)定后，開始實驗觀察。于8:00～13:00 的固定時間測量血壓，將大鼠放入（37±1）℃電熱恒溫箱內(nèi)預熱15 min后，測定大鼠尾收縮期動脈壓（Systolic blood pressure，SBP）及舒張期動脈壓（diastolic blood pressure，DBP）。每只大鼠尾動脈收縮壓經(jīng)無創(chuàng)血壓儀連續(xù)測量3 次，取平均值為該次測量的血壓值。

1.5.3 循環(huán)內(nèi)皮細胞計數(shù)

1.5.3.1 血液樣本采集及紅細胞裂解 于給藥后第28 d，采用EDTA-K2抗凝管經(jīng)腹主動脈采血并混勻，500 r/min 離心5 min，離心棄上清，加入6～10 倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫裂解5 min。裂解過程中宜適當搖動以促進紅細胞裂解。400～500 r/min離心5 min，棄紅色上清。重復裂解過程3 次，細胞沉淀加入10 mL PBS 重懸沉淀，500 r/min 離心5 min，棄上清，重復洗滌3 次，用1 mL PBS重懸。

1.5.3.2 流式檢測循環(huán)內(nèi)皮細胞 取100 μL 細胞懸液，加入10 μL PE-mouse anti-Rat CD31 抗體，及10 μL FITC-anti-Rat CD45 抗體，混勻后，室溫避光孵育20 min，1500 r/min 離心5 min，棄上清，加入2 mL PBS緩沖液洗滌;1500 r/min離心5 min，棄上清，重復洗滌3 次，加入1 mL PBS 緩沖液重懸細胞沉淀，上機檢測。調(diào)整FSC、SSC電壓，獲取10000個細胞進行分析。以對數(shù)FSC作X軸，對數(shù)SSC作Y軸，選取單核細胞圈門，另開一個窗，以對數(shù)FITC-CD45 作X 軸，PECD31作Y 軸，以對照管調(diào)整坐標的位置，分析CD31+/CD45-細胞的百分比。

1.5.4 HE 染色檢測 大鼠取血后，迅速取胸主動脈，置于4%多聚甲醛中固定，浸蠟包埋，常規(guī)切片，HE 染色觀察血管組織形態(tài)學變化。采用Pannoramic 250 數(shù)字切片掃描儀對切片進行圖像采集，每張切片先于40倍下觀察全部組織，觀察大體病變，選擇要觀察的區(qū)域采集400倍圖片，觀察具體病變。

1.5.5 Masson 染色檢測 大鼠取血后，迅速取胸主動脈，置于4%多聚甲醛中固定，浸蠟包埋，常規(guī)切片，切片常規(guī)脫蠟至水，天青石藍染色液、Mayer蘇木素染色液及麗春紅品紅染色液分別進行染色，陽性表達：膠原纖維、軟骨呈藍色，肌纖維、纖維素、肌肉、神經(jīng)膠質(zhì)、胞漿呈紅色，紅細胞呈橘紅色，胞核呈黑藍色。所得切片采用Pannoramic 250數(shù)字切片掃描儀對切片進行圖像采集，每張切片先于100 倍下觀察全部組織，再根據(jù)組織大小及表達情況分別選取3 代表性區(qū)域采集400 倍圖像。用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的光密度（integrated optical density，IOD）和面積（Area），測量出血管壁厚度(Wall thickness,WT)、內(nèi)徑(Luminal diameter,LD）、中膜厚度（Mesdia thickness,MT）、血管橫截面積（WalL crosssectional area,WCSA）、管腔面積(Luminall cross-sectional area,LCSA)，以及壁厚內(nèi)徑比（WT/LD）、壁腔橫截面積比（WCSA/LCSA），另在20 倍下拍照觀察血管結構。

1.6 統(tǒng)計分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準（)表示。對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，若滿足正態(tài)性和方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD 檢驗；若方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 對SHR 收縮壓及舒張壓的影響經(jīng)適應性喂養(yǎng)2周后，模型組、EB組及SQ組的SBP和DBP均顯著高于正常對照組（P＜0.01），并達到高血壓狀態(tài)，而模型組、SQ 組及EB 組各組間SBP 和DBP 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明造模成功。給藥期間：與正常對照組相比，模型組不同時間段SBP 均升高(P＜0.01)，且呈逐漸上升趨勢；與模型組相比，EB組和SQ組不同時間段均能有效降低SBP 和DBP（P＜0.05，P＜0.01），但EB 組與SQ 組兩組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結果見表1、表2。

表1 各組大鼠不同時間SBP監(jiān)測結果（，mmHg）

表1 各組大鼠不同時間SBP監(jiān)測結果（，mmHg）

注：與正常對照組，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組EB組SQ組給藥前118.12±12.56 163.57±10.61*166.91±12.29*164.42±7.07*給藥時28 d 131.91±5.81 178.57±12.27*158.53±9.78*△156.78±11.74*△7 d 121.79±8.61 168.43±6.18*151.26±13.10*△159.07±5.98*△14 d 126.85±4.72 168.87±4.90*147.05±6.94*△△152.10±5.12*△△21 d 122.22±14.59 170.52±9.78*156.00±8.78*△△157.71±8.35*△

表2 各組大鼠不同時間DBP監(jiān)測結果（，mmHg）

表2 各組大鼠不同時間DBP監(jiān)測結果（，mmHg）

注：與正常對照組，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組EB組SQ組給藥前73.16±3.60 111.76±8.02*113.59±9.26*110.68±13.67*給藥時28 d 86.73±9.79 128.12±10.69*106.61±14.45*△105.46±10.03*△△7 d 82.01±13.67 116.91±8.14*106.12±9.15*△103.08±8.44*△14 d 93.29±9.04 109.36±6.11*98.96±12.53*88.29±6.06*△△21 d 85.55±7.01 114.77±10.80*87.16±8.09*△△98.16±7.67*△

2.2 循環(huán)內(nèi)皮細胞計數(shù)結果實驗4 w 后，與正常對照組比較，模型組、EB組循環(huán)內(nèi)皮細胞計數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），SQ 組循環(huán)內(nèi)皮細胞計數(shù)升高，但差異比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，EB組、SQ組循環(huán)內(nèi)皮細胞計數(shù)均有顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；EB組與SQ組兩組循環(huán)內(nèi)皮細胞計數(shù)無統(tǒng)計學意義差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測結果（，‰）

表3 各組大鼠循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測結果（，‰）

注：與正常對照組，*P＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01。

組別正常對照組模型組EB組SQ組循環(huán)內(nèi)皮細胞計數(shù)比例0.43±0.29 17.10±7.80*1.15±0.51*△△0.96±0.63△△

2.3 對胸主動脈病理形態(tài)的影響實驗4 w 后，與正常對照組相比，模型組大鼠血管組織內(nèi)皮損傷明顯，內(nèi)膜不完整，明顯增厚，可見受損變性的內(nèi)皮細胞脫落于管腔內(nèi)，肌纖維排列不整齊，粗細不一，平滑肌細胞明顯增殖，膠原纖維減少，外膜增厚；EB 組大鼠血管內(nèi)膜完整光滑，可見極少量受損變性的內(nèi)皮細胞脫落于管腔內(nèi)；SQ組大鼠血管內(nèi)膜輕度損傷，內(nèi)膜相對完整，可見少量內(nèi)皮細胞脫落，中膜增厚，肌纖維排列紊亂，外膜較厚。結果顯示，桑芪首烏片對高血壓血管損傷具有一定的保護作用。見圖1。2.4 Masson 染色結果利用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測定顯示：與正常對照組相比，模型組、SQ組及EB 組LD、WCSA、LCSA、WT、MT 明顯增大（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，SQ 組、EB 組LD、WT/LD、WCSA、LCSA、WCSA/LCSA、WT、MT 均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；對比EB組，SQ組LD、WT/LD、WCSA、LCSA、WT、MT有所增大，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明，桑芪首烏片能夠降低血管纖維化水平。見表4、表5、圖2。

圖1 各組大鼠主動脈的病理檢測情況（HE，400×）

圖2 各組大鼠Masson染色下纖維組織（HE，400×）

表4 各組大鼠胸主動脈血管內(nèi)徑變化情況（，mm2）

表4 各組大鼠胸主動脈血管內(nèi)徑變化情況（，mm2）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05，*P＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組EB組SQ組WT 0.15±0.01 0.21±0.03▲0.16±0.01▲△0.17±0.02▲△LD 1.44±0.10 2.05±0.12*1.81±0.16*△△1.84±0.15*△△WT/LD 0.10±0.02 0.10±0.01 0.09±0.01△△0.09±0.00△△MT 0.13±0.01 0.20±0.03▲0.15±0.01▲△0.16±0.02▲△

表5 各組大鼠胸主動脈血管面積變化情況（，mm2）

表5 各組大鼠胸主動脈血管面積變化情況（，mm2）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常對照組模型組EB組SQ組WCSA 2.45±0.18 4.86±0.68*3.79±0.53*△△3.77±0.61*△△LCSA 1.70±0.20 3.33±0.40*2.73±0.44*△△2.70±0.43*△△WCSA/CSA 1.45±0.07 1.45±0.04 1.39±0.04△△1.40±0.02△△

3 討論

高血壓是目前嚴重威脅人類身體健康的慢性心腦血管病，有著極高的發(fā)病率和致死率，全世界每年由高血壓并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)高達940萬人[10]。根據(jù)我國流行病學研究，血壓120～129/80～84 mmHg和130～139/85～89 mmHg 的中年人群，10 年后分別有45%和64%發(fā)展成為高血壓患者[11-12]。因此，高血壓早期干預能夠有效降低心血管事件。血管內(nèi)皮是血流和血管壁之間的機械和生物屏障，具有合成、釋放多種血管活性物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)血管張力、凝血、炎癥、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和誘導血管平滑肌細胞分化的功能[13-14]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)作為心血管重要的神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)，其多種代謝產(chǎn)物作用于內(nèi)皮細胞受體和信號通路發(fā)揮維持血壓和調(diào)控心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，其中Ang II 是該系統(tǒng)最主要的病理效應分子[15-16]。研究表明，Ang II引起血管平滑肌收縮，激活炎性因子和氧化應激、誘導血管平滑肌細胞增殖，造成內(nèi)皮細胞的功能失調(diào)和結構損傷[17]。通過降低Ang II的合成和阻斷受體信號通道，能夠提高內(nèi)皮細胞對血清NO 的生物利用度，減輕高血壓患者的炎癥和氧化應激反應，從而改善外周血管內(nèi)皮功能[18]。課題組既往實驗表明：桑芪首烏片能夠降低Ang II 水平，多途徑作用于RAAS 系統(tǒng)發(fā)揮降壓效果[6]，因此，本實驗中選擇厄貝沙坦片為陽性對照藥，觀察桑芪首烏片通過抑制Ang II對SHR血壓及內(nèi)皮細胞的影響作用。

內(nèi)皮細胞衰老或受損后從基底脫落，循環(huán)于外周血中，稱循環(huán)內(nèi)皮細胞（circulating endothelial cells,CECs）。正常人體內(nèi)CECs的數(shù)量非常少，然而在內(nèi)皮受損的病理狀態(tài)下，循環(huán)內(nèi)皮細胞會發(fā)生數(shù)量和形態(tài)學的變化。有人認為，CECs 是目前在活體內(nèi)的唯一可以直接反映血管內(nèi)皮損傷的標志物，可用來評判內(nèi)皮功能和穩(wěn)態(tài)[19]。本研究表明，SHR 隨著周齡增長血壓持續(xù)升高，至10 周齡左右血壓趨于穩(wěn)定并達到高血壓狀態(tài)。與正常對照組相比，模型組的CECs 顯著升高，表明高血壓狀態(tài)下血管存在內(nèi)皮結構和功能的破壞。經(jīng)厄貝沙坦片和桑芪首烏片干預后，兩組CECs均有不同程度的下降，提示厄貝沙坦片和桑芪首烏片在降低血壓的同時，能夠改善內(nèi)皮細胞損傷，推測可能與桑芪首烏片降低RAAS中Ang II水平有關。

目前對于內(nèi)皮功能紊亂及高血壓發(fā)生的先后順序尚無定論[20]。但能肯定的是，持續(xù)性的內(nèi)皮功能紊亂可加速內(nèi)皮細胞衰老、凋亡，血管平滑肌細胞異常增殖、遷移，以及細胞外基質(zhì)纖維化、鈣化，造成血管重構，是高血壓持續(xù)發(fā)展和靶器官損害的高危因素[21-22]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，胸主動脈的形態(tài)學方面，模型組的血管壁厚度、腔壁橫截面均較正常對照組明顯增加，且HE 染色結果顯示，SHR 內(nèi)膜不光滑，血管壁明顯增厚，中膜平滑肌細胞增殖肥大，肌纖維排列紊亂，證實了高血壓狀態(tài)下大血管出現(xiàn)管腔擴大、管壁增厚，中膜平滑肌細胞增殖、結構紊亂及內(nèi)膜內(nèi)皮細胞脫落等血管重構特征。經(jīng)桑芪首烏片及厄貝沙坦片干預后，兩組血管形態(tài)學指標均下降。而HE 染色同時提示EB 組、SQ 組的內(nèi)膜較光滑，中膜厚度較模型組明顯減少，內(nèi)皮損傷和血管平滑肌細胞異常增殖不同程度受到抑制，降低了血管重構情況，對血管起到保護作用。結合CECs 指標的變化，推測可能的機制是：桑芪首烏片降低Ang II 水平，從而阻斷了炎性因子和氧化應激反應的過度激活對內(nèi)皮細胞的損傷，保護了血管內(nèi)皮的完整性，延緩血管重構的進程。

桑芪首烏片中桑寄生、制何首烏為君藥，兩者性微溫而質(zhì)潤，即所謂陰中之陽藥，溫而不燥，具有滋補肝腎，平調(diào)陰陽之功；黃芪、三七、天麻、鉤藤共為臣藥，具有益氣活血、平肝息風之功；白芍、當歸、黃柏、浮小麥、炒麥芽共為佐藥，行養(yǎng)血和營、清肝腎浮火、健脾行氣之效，使得肝腎精血生化有源，氣機升降有常。全方合用，達到補陰而潛陽亢，益陽而通脈絡，以恢復人體“陰平陽秘”的狀態(tài)，使得血液運行有常，血壓隨之得降的目的。現(xiàn)代藥理研究顯示：桑芪首烏片中多種藥物，如黃芪、制何首烏、鉤藤、三七等的有效活性成分都能影響血管內(nèi)皮重構過程，改善血管內(nèi)皮功能障礙而發(fā)揮血管保護效應[23-25]?？梢?，中醫(yī)藥治療高血壓血管內(nèi)皮功能障礙具有多靶點、多途徑的優(yōu)勢。

綜上所述，桑芪首烏片在降血壓的同時，能明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠CECs 計數(shù)，病理組織學提示大血管內(nèi)皮細胞損傷和血管平滑肌細胞異常增殖不同程度受到抑制，具有保護血管內(nèi)皮功能及結構完整性的作用。但桑芪首烏片降壓效果與內(nèi)皮功能改善、抑制RAAS 系統(tǒng)以及改善血管重構途徑之間的關系尚有待于更深入的研究，如何明確這些靶點和闡明作用機制是今后研究的方向和思路。