宋冬林，王玉良

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是最常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎衰竭的主要原因，其中氧化應(yīng)激與慢性炎性反應(yīng)被認為是DKD發(fā)病的關(guān)鍵所在，目前DKD的治療方法主要以低蛋白飲食、控制血糖血壓、調(diào)節(jié)血脂水平等為主。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有多層次、多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點的作用特點，木香為常用中藥材，其所含木香烴內(nèi)酯(costunolide,CS)具有抗氧化應(yīng)激和抗炎作用，可抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)及活化κ基因結(jié)合核因子(nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB)，產(chǎn)生抗炎作用。同時還具有通過核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(nuclear factor erythroid 2-related factor 2/antioxidant responseelement，Nrf2/ARE)依賴途徑，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用。本研究旨在探討CS對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠70只，雄性、8周齡，體重(260±20)g，清潔級,由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(軍)2012-0004。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件：室溫恒定于22～25 ℃，相對濕度55%～60%，光照時間12 h/d，食物和純凈水可自由攝取。

1.2 藥物及試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，Sigma公司)；甘精胰島素(賽諾菲安萬特制藥有限公司)；木香烴內(nèi)酯(中國藥品生物制品研究所110765-200710)；血糖儀及試紙(美國強生穩(wěn)豪倍優(yōu)型血糖儀)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、核蛋白提取試劑盒(南京建成工程研究所)；Histone H、GAPDH、 NF-кB p65、κB抑制劑激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)兔多克隆抗體(美國CST公司)；Nrf2、血紅素氧合酶1(hemeoxygenase1，HO-1)兔單克隆抗體(英國Abcam公司)；二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA試劑盒(天津潤泰科技發(fā)展有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模 隨機分出12只設(shè)為正常組，予以普通飼料飼養(yǎng)；其余58只大鼠給予高脂高糖飼料(在普通飼料中加入10%豬油和20%蔗糖，混勻干燥后消毒滅菌)8周后，鼠尾靜脈注射STZ(30 mg/kg，溶于0.1 mol/L無菌枸櫞酸緩沖液，pH 4.4)，注射后72 h檢測尾靜脈血糖，以連續(xù)3 d 血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠成模標準。共剔除7只，造模過程死亡2只，剩余49只隨機分為糖尿病組(13只)，胰島素組(12只)，木香烴內(nèi)酯低、高劑量組(各12只)。其中CS低、高劑量組每天給予CS灌胃10 mg/kg、20 mg/kg，正常組與糖尿病組均給予等量生理鹽水灌胃，胰島素組每天給予甘精胰島素皮下注射，2 U/(kg/d)。各組均給藥8周。

1.3.2 標本獲取與分析 于給藥后每周測定各組大鼠體重、血糖。給藥8周后，全部大鼠予10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血分離血清測定肌酐、尿素氮濃度，部分血清-80 ℃凍存作相關(guān)指標測定，大鼠頸椎脫臼法處死后快速剝離雙腎，切取部分腎臟組織4%中性甲醛固定做HE染色病理切片，剩余組織-80 ℃凍存作相關(guān)指標測定。

1.3.3 腎組織病理學觀察 固定的腎組織，石蠟包埋，常規(guī)切片，進行HE染色，切片在光鏡下經(jīng)數(shù)字CCD獲取圖像(×100)。

1.3.4 血清抗氧化指標和腎臟組織炎性因子檢測 按照試劑盒說明書步驟檢測大鼠血清SOD、GSH及MDA含量，制取腎臟組織勻漿后采用ELISA法檢測IL-6、TNF-α表達水平，具體方法依照ELISA試劑盒說明書進行。

1.3.5 測定腎臟組織中Nrf2、HO-1及NF-кB p65、IKKβ表達 取低溫冰箱保存的200 mg腎臟組織，用預冷的生理鹽水沖洗后，在冰上研磨，利用核蛋白提取試劑盒提取總蛋白和核蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，各組樣本分別取總蛋白100 μg變性后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行蛋白質(zhì)分離，后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，將膜室溫封閉 5 h。與特異性的一抗4 ℃孵育過夜，與二抗室溫孵育2 h后，化學發(fā)光法顯影于X膠片掃描后，核內(nèi)蛋白以Histone H 作為標準內(nèi)參，胞漿蛋白以GAPDH作為標準內(nèi)參。采用 Quantityone圖像分析軟件對蛋白條帶進行分析，蛋白相對表達含量以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 正常組大鼠一般情況良好，成模鼠逐漸出現(xiàn)飲水、進食及尿量增加，皮毛凌亂而無光澤，體重增長緩慢，活動減少。藥物干預后，CS低、高劑量組與糖尿病組比較，上述表現(xiàn)顯著改善。造模過程中死亡2只，CS低劑量組和胰島素組各死亡1只，CS高劑量組未出現(xiàn)動物死亡。

2.2 CS對糖尿病大鼠血糖及腎功能的影響 藥物干預第2周CS高劑量組血糖低于糖尿病組，有統(tǒng)計學差異(=0.035)，第4周CS低劑量組血糖低于糖尿病組，有統(tǒng)計學差異(=0.001)。但CS低、高劑量組血糖水平仍高于胰島素組(<0.01)。CS治療組大鼠血清肌酐、尿素氮濃度均低于糖尿病組，肌酐低于胰島素組(<0.01)，CS高劑量組水平較CS低劑量組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 各組大鼠血糖及腎功能變化情況

2.3 CS對糖尿病大鼠腎臟病理改變的影響 HE染色顯示:正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小球囊壁光滑，腎小管上皮排列整齊，系膜細胞分布正常，毛細血管管腔清晰，未見增生及纖維化表現(xiàn)；糖尿病組大鼠腎小球體積增大，腎小球內(nèi)細胞數(shù)目增多，腎小囊變窄，少數(shù)腎小球出現(xiàn)輕度硬化，部分腎小管上皮細胞腫脹，空泡變性，系膜細胞增殖，部分間質(zhì)小血管玻璃樣變性；給藥組尤其是CS高劑量組大鼠上述病變明顯較糖尿病組減輕，表現(xiàn)為腎小球體積輕度增大，未見腎小球囊粘連，腎小管上皮細胞腫脹較輕，腎小球系膜輕度增寬，基底膜輕度增厚(圖1)。

圖1 各組糖尿病實驗大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果(×100)

2.4 CS對糖尿病大鼠血清SOD、GSH、MDA及腎臟IL-6、TNF-α的影響 糖尿病組大鼠血清SOD、GSH均顯著減少，而CS低、高劑量組SOD、GSH的水平均明顯增高。氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA在糖尿病組中增加，而CS低、高劑量組均顯著降低。CS低、高劑量組腎臟組織中IL-6、TNF-α水平均低于糖尿病組，差異有統(tǒng)計學意義。CS高劑量組GSH水平高于CS低劑量組(=0.024)，而IL-6低于CS低劑量組(<0.01)，見表2。

表2 各組糖尿病實驗大鼠血清SOD、GSH和MDA的變化情況

2.5 CS對糖尿病大鼠腎臟Nrf2、HO-1、NF-кB p65、IKKβ蛋白表達的影響 糖尿病組腎臟組織中的Nrf2、HO-1蛋白表達較正常組顯著降低，而CS低、高劑量治療均可以顯著增加糖尿病大鼠腎臟Nrf2，HO-1蛋白的表達，與糖尿病組比較有統(tǒng)計學差異(<0.05)。糖尿病組腎臟組織中NF-кB p65、IKKβ蛋白表達較正常組顯著升高，而CS低、高劑量組均可以顯著下調(diào)糖尿病大鼠腎臟NF-кB p65、IKKβ蛋白的表達，與糖尿病組相比均具有統(tǒng)計學差異(<0.05)(圖2、表3)。

圖2 各組糖尿病實驗大鼠腎臟組織中NF-кB p65、Nrf2、IKKβ、HO-1蛋白水平

表3 各組糖尿病實驗大鼠腎臟中的NF-кB p65、IKKβ、Nrf2、HO-1蛋白變化情況

3 討 論

糖尿病患者中有20%～40%發(fā)生DKD，是糖尿病患者腎衰竭的主要原因。DKD 發(fā)病機制復雜，其中氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)是DKD 發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。糖代謝紊亂產(chǎn)生過多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)可使細胞外基質(zhì)增加，刺激腎小球系膜細胞增殖，增加血管通透性，引起基底膜增厚、腎小球肥大和硬化。Nrf2是近年新發(fā)現(xiàn)的機體抗氧化功能最重要的防御性轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2通過調(diào)控Ⅱ相酶的表達，誘導機體細胞產(chǎn)生自然保護反應(yīng)，目前被認為是對抗糖尿病引起的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)的新通路。HO-1是Nrf2/ARE通路轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的抗氧化蛋白，其表達與Nrf2具有相關(guān)性。單核/巨噬細胞浸潤是糖尿病腎病炎性反應(yīng)的特征性表現(xiàn)之一，NF-κB是介導炎性反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，其過度激活可導致多種炎性反應(yīng)因子的表達分泌異常。炎性細胞通過分泌TNF-ɑ、IL-1、IL-6 等細胞因子和炎性介質(zhì)，以及產(chǎn)生ROS等造成腎組織結(jié)構(gòu)的破壞，加速腎小球硬化的進程。

中藥木香味辛、苦、性溫，入脾、胃、大腸、三焦經(jīng)，主治脾、胃、大腸、肝膽病。CS是從木香屬類植物中提取的一類倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有廣泛的藥理活性，是中藥木香的主要化學成分和質(zhì)量控制成分之一,具有抗腫瘤、降血糖、抑制機體對乙醇的吸收、抑制微生物活性等作用，以及抗炎和抗氧化雙重作用。本研究首次證實，CS對糖尿病大鼠腎臟損傷具有保護作用，可能與降低血糖及減輕氧化應(yīng)激損傷、抑制慢性炎性反應(yīng)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，CS治療組大鼠多飲、多尿緩解，體重有所增加，腎臟功能及病理損傷改善明顯；CS具有一定的降糖作用且有量效關(guān)系，但其降糖作用與胰島素治療組相比仍有差距，說明CS緩解糖尿病大鼠癥狀及改善腎臟結(jié)構(gòu)功能可能還有獨立于降糖作用之外的途徑。Eliza 等報道了CS的降糖及調(diào)脂作用，最初認為是通過抑制NO合成酶的表達而促進胰島β細胞分泌胰島素，后續(xù)研究證明CS是通過抑制氧化應(yīng)激而起作用。氧化應(yīng)激還能加劇胰島β細胞的凋亡，降低胰島素的合成與分泌，從而進一步加劇糖代謝紊亂。腎臟對氧化應(yīng)激比較敏感，因而也是氧化應(yīng)激的主要靶點。糖代謝紊亂過程中會產(chǎn)生大量氧自由基，這些產(chǎn)物不僅會直接導致腎臟組織和細胞損傷，還可以激活一系列氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷信號通路，從而加重氧化損傷。SOD、GSH、維生素E是機體清除氧自由基的屏障，通過抗氧化治療能夠逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對組織的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠的血清中SOD、GSH顯著降低，而氧化應(yīng)激的主要標志物MDA顯著增加，CS治療組可以顯著增加SOD、GSH含量，降低MDA的表達，并且CS對糖尿病大鼠血清GSH的影響還具有量效關(guān)系。同時CS還可以顯著增加氧化應(yīng)激核心轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的核內(nèi)表達，增加Nrf2通路中的核心因子HO-1蛋白的表達。說明CS在改善DKD損傷中可能通過調(diào)節(jié)Nrf2通路來發(fā)揮抗氧化作用。慢性炎性反應(yīng)是DKD發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，轉(zhuǎn)錄因子NF-кB是控制炎性基因表達的樞紐，NF-кB的過度活化是DKD發(fā)生的重要原因。IKK復合體在NF-кB的信號轉(zhuǎn)導途徑中起著重要作用, 其中IKKβ是IKK復合體的酶活性亞單位，其激活或者失活將直接影響NF-кB的活化及底物蛋白的磷酸化、降解。

糖尿病相關(guān)高血糖、ROS的生成、基化終末產(chǎn)物與其特異性受體的結(jié)合等途徑均可刺激體內(nèi)NF-кB的激活,活化的NF-кB進一步介導下游炎性因子、趨化因子的形成和大量釋放，這些因子的釋放可引發(fā)機體慢性炎性反應(yīng)，造成糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟中NF-кB p65在核內(nèi)表達增高，同時伴有NF-кB輔助活化因子IKKβ增高；同時還發(fā)現(xiàn)，炎性因子IL-6、TNF-α在糖尿病大鼠腎臟組織中也顯著升高，而CS可以顯著抑制這些炎性因子，所有炎性指標均較糖尿病組明顯降低，并且CS對糖尿病大鼠IL-6的降低還具有量效關(guān)系。說明CS在緩解DKD損傷中可能通過調(diào)節(jié)NF-кB通路來發(fā)揮抗炎性反應(yīng)作用。有研究發(fā)現(xiàn)CS除抑制NO產(chǎn)生和NF-κB活化外，也能降低MAPKs蛋白激酶的活化和AP-1蛋白的DNA結(jié)合活性，從而抑制單核巨噬細胞IL-1β基因的表達。 近期有研究表明，在炎性疾病中CS可下調(diào)過度表達的NF-κB，降低組織TNF-α水平起到治療炎性疾病的作用。由于NF-кB信號通路在許多炎性疾病過程中發(fā)揮重要作用，所以成為開發(fā)治療炎性疾病藥物的重要靶點。

綜上所述，CS可以顯著保護糖尿病大鼠早期腎臟損傷，這種保護功能可能是通過調(diào)節(jié)Nrf2通路來發(fā)揮抗氧化作用，以及影響NF-кB通路發(fā)揮抗炎的雙重作用來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果為今后CS的臨床應(yīng)用及DKD的防治提供了新的方向，但在CS抗氧化與抗炎作用，以及診斷DKD治療靶點方面還有待進一步研究。