袁茂翼,崔瀟文,葉發(fā)銀,趙國華,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715) 2(貴州省遵義市鳳岡縣疾病預(yù)防控制中心,貴州 遵義,563000)3(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶,400715)

蘋果是世界四大水果之一,在全球的種植面積約500萬hm2,規(guī)模穩(wěn)居世界首位,我國蘋果果汁作為蘋果加工制品的主導(dǎo)部分,年生產(chǎn)總量約占世界的60%,是支持進(jìn)出口貿(mào)易及地域性經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)之一[1]。在蘋果果汁加工中產(chǎn)生大量果渣副產(chǎn)物,其含有豐富的碳水化合物、果膠、多酚、粗纖維等營養(yǎng)物質(zhì),其中蘋果多酚主要包括綠原酸、根皮苷、表兒茶素及其低聚體和槲皮酮糖苷等,表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗衰老和抗癌等生理功能[2]。但是由于多酚類物質(zhì)常通過糖苷鍵形式與碳水化合物結(jié)合,以及皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的阻隔作用,使得多酚的提取和利用受到一定限制,造成多酚資源浪費(fèi)。因此,采取適當(dāng)?shù)钠票陬A(yù)處理方法從蘋果皮渣中充分提取和利用多酚類物質(zhì)是充分發(fā)揮蘋果營養(yǎng)保健作用、提高其附加值的有效途徑。目前,有研究利用微波、超聲波或超高壓技術(shù)來輔助提取蘋果多酚,如高義霞等[3]利用果膠酶結(jié)合微波法提取蘋果多酚,在最優(yōu)工藝條件下(果膠酶用量1.7 mg在50 ℃酶解2 h,微波功率380 W提取2 min,重復(fù)提取2次)多酚得率為(12.26±0.213)mg/g;賀金娜[4]利用超聲輔助乙醇提取蘋果多酚,在最優(yōu)處理?xiàng)l件下多酚的提取率為11.5 mg/g。雖然以上方法可以在一定程度提高蘋果皮渣多酚的提取效率,但破壁作用有限,且已有研究表明,當(dāng)微波處理10 min后會(huì)導(dǎo)致部分熱敏性多酚的降解和多酚抗氧化活性的降低[5],此外,也可能導(dǎo)致多酚降解產(chǎn)物復(fù)雜難以分離鑒定,從而低估其功能活性及價(jià)值。蒸汽爆破技術(shù)是近年來新興的一種綠色預(yù)處理技術(shù),能在短時(shí)間(3～5 min)的高溫(160～260 ℃)高壓(0.69～4.83 MPa)條件下利用蒸汽充分滲透潤脹物料,并通過瞬間釋壓將物料破碎,以促進(jìn)生物活性成分的釋放溶出[6],具有操作簡便,高效環(huán)保,對(duì)熱敏性營養(yǎng)成分的保留率高的優(yōu)點(diǎn)[7]。SECMELER等[8]在200 ℃下蒸汽爆破處理橄欖果渣5 min,所得的總酚含量比未處理樣品增加了12%。LIU等[9]在215 ℃蒸汽爆破處理麥麩120 s,提取所得的多酚含量為處理前的39倍;LI等[10]的研究也證實(shí)蒸汽爆破處理對(duì)苦蕎麩皮酚類物質(zhì)的溶出及體外細(xì)胞抗氧化活性具有明顯的促進(jìn)作用,顯著提高了其結(jié)合沒食子酸,原兒茶素及咖啡酸的含量。蘋果皮渣作為一種潛在的多酚資源原料,已得到廣泛的提取及利用,而許多研究已經(jīng)證實(shí)蒸汽爆破是一種高效預(yù)處理纖維原料[11],促進(jìn)多酚釋放及改善抗氧化能力的潛在新方法,但目前蒸汽爆破處理蘋果皮渣鮮見報(bào)道,也缺乏蒸汽爆破處理對(duì)多酚組分及抗氧化活性具體影響的研究。利用蒸汽爆破處理蘋果皮渣,探究不同爆破條件對(duì)蘋果皮渣中多酚類物質(zhì)的含量、組成的影響,以及爆破處理后的蘋果皮渣在消化前后的抗氧化活性、表面結(jié)構(gòu)的變化。以期為蘋果皮渣多酚的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果皮渣,四川省涼山州鹽源縣美青源食品有限公司,為去皮整蘋果的加工副產(chǎn)物。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 、2,2’-聯(lián)氨雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、鞣花酸、根皮苷、槲皮苷、槲皮素,色譜純,美國sigma公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TPTZ),分析純,梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;乙腈、甲酸、磷酸、甲醇,色譜純,重慶市鈦新化工有限公司;丙酮、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯等其他試劑均為分析純,成都科龍化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-8GB汽爆工藝試驗(yàn)臺(tái),鶴壁正道生物能源有限公司;UltraScan PRO測(cè)色儀,美國HunterLab公司;Phenom Pro掃描電子顯微鏡,荷蘭Phenom World公司;L6紫外/可見分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;LC-20A高效液相色譜,島津企業(yè)管理(中國)有限公司;TGL-16G離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蒸汽爆破處理蘋果皮渣

將蘋果皮渣粉碎過60目篩,收集樣品(含水量約5%)。將樣品進(jìn)行蒸汽爆破處理,每次爆破樣品進(jìn)樣量不超過400 g,設(shè)備經(jīng)點(diǎn)火操作后,待壓力分別升至1.0、1.5和2.0 MPa后,接通蒸汽加熱60 s,收集樣品,60 ℃烘干過60目篩,置于干燥器保存?zhèn)溆?未經(jīng)爆破處理的樣品為對(duì)照組。

1.3.2 蘋果皮渣多酚提取及測(cè)定

游離態(tài)多酚提取參考文獻(xiàn)[11]：1.00 g樣品加入50 mL 80%冷凍丙酮水溶液,避光劇烈攪拌提取10 min,3 558×g離心10 min,收集上清液,殘?jiān)僦貜?fù)提取1次,合并上清液,45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用甲醇定容于25 mL棕色容量瓶,保存在-20 ℃下備用。

結(jié)合態(tài)多酚提取參考文獻(xiàn)[12]：上述提取游離態(tài)多酚后的殘?jiān)尤?0 mL 2 mol/L NaOH溶液,并轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,室溫下磁力攪拌1 h,取出后放入冰水浴中,濃鹽酸調(diào)整混合物pH至7,接著加入20 mL正己烷劇烈振蕩5 min,去除脂肪,3 558×g離心10 min,去掉上清液。向殘?jiān)屑尤?0 mL乙酸乙酯提取,振蕩10 min,離心,收集上清液,之后操作如上,45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用甲醇定容于5 mL棕色容量瓶,保存在-20 ℃下備用。

游離酚和結(jié)合酚的測(cè)定采用福林酚比色法[13],以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),得到線性回歸方程：y=0.006 2x+0.017 6,R2=0.996 3,沒食子酸濃度的線性范圍是0～100 μg/mL。

1.3.3 游離態(tài)多酚定量和定性測(cè)定

采用HPLC對(duì)蘋果皮渣的游離態(tài)多酚進(jìn)行定性定量分析[10]。色譜柱：Thermo BDS-C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm),柱溫40 ℃,進(jìn)樣量5 μL,檢測(cè)波長320、280 nm;流動(dòng)相：A相：甲醇,B相：0.1%磷酸,流速0.4 mL/min。梯度洗脫方法：0 min,A相85%,B相15%;30 min,A相40%,B相60%;35 min,A相20%,B相80%;40 min,A相10%,B相90%;50 min,A相85%,B相15%;60 min,A相85%,B相15%。

1.3.4 蘋果皮渣粉末及體外模擬消化液抗氧化活性測(cè)定

1.3.5 蘋果皮渣表面結(jié)構(gòu)特征表征

1.3.5.1 色差測(cè)定

利用測(cè)色儀對(duì)蘋果皮渣蒸汽爆破前后顏色進(jìn)行測(cè)定,亮度為L*、紅度為a*、黃度為b*。

ΔE=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2

式中：ΔL*=L-L0,Δa*=a-a0,Δb*=b-b0,L0、a0、b0分別是原樣的亮度、紅度和黃度,L、a、b是處理后樣品的亮度、紅度和黃度。

1.3.5.2 微觀結(jié)構(gòu)表征

利用掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)對(duì)皮渣微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,導(dǎo)電膠將少量提前干燥好的蘋果皮渣粉末固定在樣品座上,再將樣品座置于離子濺射儀中鍍鉑金膜約30 s后,利用SEM在10 kV的加速電壓條件下放大3 000倍觀察樣品的形態(tài)特征并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(means±SE)表示,并采用Excel軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,顯著性分析采用單因素方差分析的Duncan’s檢驗(yàn),P<0.05判定為具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸汽爆破前后蘋果皮渣多酚含量變化

蒸汽爆破處理前后蘋果皮渣的多酚含量如表1所示,蒸汽爆破處理后游離態(tài)多酚和總酚含量均有所提高,在1.5和2.0 MPa條件下,游離態(tài)多酚含量分別較原樣顯著提高了15.11%和19.85%,總酚含量分別較原樣顯著提高了16.28%和18.51%,這與LI等[10]蒸汽爆破處理苦蕎麩皮的研究結(jié)果一致,其中,含量的增加可能與物料結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的變化有關(guān)。許多研究表明蒸汽爆破處理可以有效破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),增大組織孔隙與比表面積,有助于改善多酚提取過程中溶質(zhì)的傳質(zhì)速率,從而提高多酚的溶出率和提取率[6]。

表1 蒸汽爆破處理60 s對(duì)蘋果皮渣的多酚含量的影響 單位：mg/100 g

此外,蒸汽爆破處理過程中高溫水蒸汽也可以占據(jù)與纖維素結(jié)合的多酚羥基位點(diǎn),有利于多酚的溶出[9]。而蒸汽爆破處理后結(jié)合態(tài)多酚含量有所降低,在1.5和2.0 MPa條件下分別較原樣顯著降低了13.77%和22.73%,這可能是由于高強(qiáng)度蒸汽爆破的熱作用使生物質(zhì)降解形成了有機(jī)酸,導(dǎo)致部分與之結(jié)合的結(jié)合酚類物質(zhì)發(fā)生降解或聚合反應(yīng)[17]。蒸汽爆破處理后皮渣中結(jié)合態(tài)多酚含量的減少還可能導(dǎo)致物料的顏色加深,從側(cè)面反映了蒸汽爆破的熱作用可能消耗了部分多酚[18]。

2.2 蒸汽爆破對(duì)蘋果皮渣游離態(tài)多酚組分及含量的影響

a-標(biāo)品圖;b-蘋果皮渣游離態(tài)多酚HPLC圖圖1 蘋果皮渣游離態(tài)多酚的HPLC圖譜Fig.1 HPLC profile of free polyphenols in apple pomace注：1-綠原酸;2-金絲桃苷;3-異槲皮苷;4-鞣花酸;5-槲皮素-3-D-木糖苷;6-槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷;7-根皮苷;8-槲皮苷;9-槲皮素

采用外標(biāo)法利用多酚標(biāo)品校準(zhǔn)曲線對(duì)蘋果皮渣游離態(tài)多酚進(jìn)行定量分析,結(jié)果如表2所示,蒸汽爆破前后皮渣游離態(tài)多酚含量均以金絲桃苷為最高(41.29～45.01 mg/100 g),其次是槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷(29.01～32.30 mg/100 g)、根皮苷(26.09～26.80 mg/100 g)及綠原酸(17.11～26.54 mg/100 g),表明蘋果皮渣游離態(tài)多酚主要以糖苷類多酚為主,酚酸類占比較小。

與未蒸汽爆破處理相比,在1.0和1.5 MPa蒸汽爆破條件下的蘋果皮渣游離態(tài)多酚含量及單體多酚含量均無顯著性變化,但在2.0 MPa蒸汽爆破條件下,游離態(tài)多酚含量從185.28 mg/100 g增加到216.07 mg/100 g,顯著提高了16.62%,此外單體多酚中綠原酸、異槲皮苷、鞣花酸、槲皮素-3-D-木糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷、根皮苷及槲皮素的含量均顯著升高。蒸汽爆破處理可以增加游離態(tài)多酚及部分單體酚含量,這在許多麩皮纖維原料中得到證實(shí),但由于不同原料的組成及結(jié)構(gòu)差異,其單體多酚變化情況也有所不同。GONG等[20]研究發(fā)現(xiàn),蒸汽爆破處理可以導(dǎo)致青稞麩皮纖維素及半纖維素的葡萄糖苷鍵水解,有利于結(jié)合態(tài)酚酸轉(zhuǎn)變和釋放,尤其是游離態(tài)阿魏酸和對(duì)香豆酸含量顯著增加。CHENG等[21]蒸汽爆破處理紅豆發(fā)現(xiàn)游離酚中原兒茶素、兒茶素、表兒茶素、香豆酸含量升高,而結(jié)合酚中兒茶素和對(duì)香豆酸含量顯著降低,推測(cè)結(jié)合態(tài)的兒茶素和對(duì)香豆酸在蒸汽爆破作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)溶出。此外,通過福林酚法所測(cè)得游離態(tài)多酚含量明顯高于通過HPLC所測(cè)單體多酚總和,可能是由于某些單體多酚含量太低,HPLC未檢測(cè)到,還有可能是由于復(fù)合酚的形成,如可溶性木質(zhì)素化合物[22-23],從而導(dǎo)致測(cè)定所得的總酚含量明顯高于單個(gè)多酚的總和。

表2 蘋果皮渣游離態(tài)多酚的組成及含量 單位：mg/100 g

2.3 蒸汽爆破對(duì)蘋果皮渣粉末及體外消化液抗氧化活性的影響

研究表明,食物經(jīng)過胃腸道消化過程可以改變活性成分的釋放及抗氧化能力的大小[24],因此對(duì)蒸汽爆破前后皮渣粉末及體外模擬消化液的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2所示。由DPPH自由基清除能力結(jié)果(圖2-a)可知,與原樣相比,蒸汽爆破預(yù)處理60 s后,樣品粉末在1.0 MPa條件下的DPPH自由基清除能力顯著增加了44.19%[3 551.62～5 121.20 μmol TE/(100 g DW)],其余2組無顯著性差異。樣品經(jīng)過體外消化后,僅2.0 MPa蒸汽爆破條件下的消化液DPPH自由基清除能力顯著增加20.43%[871.33～1 095.09 μmol TE/(100 g DW)],其他條件下沒有顯著性差異。由ABTS陽離子自由基清除能力結(jié)果(圖2-b)可知,與原樣相比,2.0 MPa蒸汽爆破條件下的蘋果皮渣粉末的ABTS陽離子自由基清除能力顯著增加了40.42%[17 148.22～24 079.72 μmol TE/(100 g DW)],推測(cè)蒸汽爆破對(duì)皮渣結(jié)構(gòu)的破壞可能促進(jìn)了消化過程中多酚的釋放。唐宇等[25]研究表明,蒸汽爆破處理的苦蕎麩皮在體外模擬消化過程中多酚釋放量顯著高于未蒸汽爆破處理的麩皮,且體外抗氧化能力和細(xì)胞抗氧化活性均得到明顯改善。蒸汽爆破前后樣品的體外消化液的ABTS陽離子自由基清除能力沒有顯著性變化。

a-DPPH自由基清除能力;b-ABTS陽離子自由基清除能力圖2 蘋果皮渣粉末及消化液的體外抗氧化能力Fig.2 Antioxidant activity in vitro of apple pomace powder and supernatant注：同樣柱子帶有不同上標(biāo)小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

總的來說,蘋果皮渣粉末的抗氧化能力高于上清液的抗氧化能力,多酚在體外消化過程中類黃酮含量及根皮苷易發(fā)生降解(主要發(fā)生腸消化階段),槲皮素和金絲桃苷中的糖苷鍵在酸性或酶反應(yīng)中也容易發(fā)生斷裂,此外,在小腸堿性條件下,一些多酚的糖苷配體骨架也可能被降解成不同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)形式[26],故而消化液抗氧化能力低于樣品粉末。BOUAYED等[27]研究了4種蘋果樣品經(jīng)過模擬胃腸道消化后消化液的FRAP和ABTS抗氧化能力顯著降低,與本研究結(jié)果一致。

2.4 蒸汽爆破對(duì)蘋果皮渣顯微結(jié)構(gòu)特征的影響

顏色改變是蒸汽爆破的特征變化之一,爆破前后樣品色差結(jié)果如表3所示。與原樣相比,隨著蒸汽爆破處理壓力的增加,亮度L*值顯著降低,分別較原樣減少了4.05%,8.38%和11.02%;紅度a*值僅在壓力2.0 MPa處理后減少了8.06%,其余條件下沒有顯著性差異;黃度b*值顯著降低,分別較原樣降低了13.98%,23.29%和33.12%;色差ΔE分別為7.14、30.71、40.11,表明色差隨著蒸汽爆破處理壓力的增加而增加,由蒸汽爆破前后樣品照片(圖3)也可以明顯看出顏色由淡黃變?yōu)樽睾稚?顏色加深,這可能是由于蘋果皮渣本身含糖量高,在此過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)導(dǎo)致色變[6],此外,多酚類物質(zhì)自氧化、苯酚氧化和酚聚合會(huì)形成棕色成分,可以加深物料的顏色[28]。

表3 蒸汽爆破處理60 s后蘋果皮渣的顏色特性Table 3 Color properties of apple pomace after SE treatment

蘋果皮渣SEM結(jié)果(圖3)所示,蒸汽爆破前蘋果皮渣結(jié)構(gòu)呈層狀,無褶皺無孔狀結(jié)構(gòu)。蒸汽爆破處理后,在1.0 MPa壓力出現(xiàn)明顯的褶皺,規(guī)則的層狀結(jié)構(gòu)被破壞。在1.5和2.0 MPa不僅有褶皺,而且出現(xiàn)了孔隙結(jié)構(gòu),并且2.0 MPa的孔隙結(jié)構(gòu)及孔隙大小均明顯多于1.5 MPa,表明蒸汽爆破處理使得物料表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。許多研究證實(shí)蒸汽爆破過程的瞬時(shí)破壁作用是促進(jìn)活性成分釋放的重要因素,多孔結(jié)構(gòu)的增加有助于改善提取過程中溶劑的可及性及溶質(zhì)的傳質(zhì)途徑,提高有效成分的提取率[29],在本研究中,也明顯發(fā)現(xiàn)了蘋果皮渣汽爆處理后表皮結(jié)構(gòu)的破裂及多孔結(jié)構(gòu)的增加,這與LORENZO-HERNANDO等[30]蒸汽爆破處理纖維素的研究結(jié)果類似,推測(cè)皮渣結(jié)構(gòu)的變化促進(jìn)了游離態(tài)多酚的溶出。

a-原樣;b-1.0 MPa;c-1.5 MPa;d-2.0 MPa圖3 蒸汽爆破處理前后蘋果皮渣的照片(a1～d1)及SEM圖(a2～d2)Fig.3 The photo and SEM pictures of apple peel residue before and after SE treatment

3 結(jié)論

蒸汽爆破預(yù)處理后蘋果皮渣結(jié)合態(tài)多酚含量降低,而游離態(tài)多酚含量顯著提高(1.5 MPa,60 s和2.0 MPa,60 s),對(duì)游離態(tài)多酚進(jìn)行定性定量分析發(fā)現(xiàn),蒸汽爆破預(yù)處理后游離態(tài)多酚種類沒有發(fā)生改變,主要是酚酸類和黃酮類,分別有綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、鞣花酸、根皮苷、槲皮苷、槲皮素、槲皮素-3-D-木糖苷、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖苷(主要是糖苷類),蒸汽爆破預(yù)處理后(2.0 MPa,60 s),除了金絲桃苷和槲皮苷外,其余多酚單體含量均顯著增加;此外,蒸汽爆破預(yù)處理后蘋果皮渣的DPPH和ABTS陽離子自由基的清除能力分別在1.0和2.0 MPa時(shí)表現(xiàn)出較高的活性,模擬體外消化后上清液的DPPH自由基清除能力在2.0 MPa時(shí)表現(xiàn)出較高的活性,而其ABTS陽離子自由基的清除能力不隨爆破壓力的增加而發(fā)生變化。色差分析表明,蒸汽爆破預(yù)處理后蘋果皮渣顏色加深,SEM表明蒸汽爆破預(yù)處理破壞了蘋果皮渣的微觀結(jié)構(gòu),增大了比表面積及孔隙率。綜上所述,蒸汽爆破對(duì)蘋果皮渣多酚釋放及抗氧化活性改善具有較好的效果,為促進(jìn)蘋果皮渣綜合利用提供一定參考。