張翔宇,王璦琳,劉祉妤,王笑涵,張思敏,申宇航,張竹君,唐越*

1(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,遼寧 大連,116034)2(國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連,116034)

蛋白質(zhì)在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其可作為乳液體系的乳化劑吸附在油水界面，降低界面張力，提高乳液的熱力學(xué)穩(wěn)定性[1]。添加表面活性劑和多糖等均可增加蛋白質(zhì)乳化性，但表面活性劑的潛在毒性及對(duì)環(huán)境的危害限制了其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，多糖的原料易獲取、安全無毒、操作簡(jiǎn)單，更適宜應(yīng)用在食品體系中。蛋白質(zhì)和多糖分子間的相互作用可分為共價(jià)(即形成美拉德反應(yīng)產(chǎn)物)和非共價(jià)相互作用(如氫鍵、空間排阻、靜電和疏水)。二者間的作用力主要取決于環(huán)境條件，如pH、溫度和濃度等[2]。利用兩者間的相互作用，可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性與功能特性，如流變學(xué)特性、界面特性等，制備不同結(jié)構(gòu)和功能特性的復(fù)合微納米膠體粒子。

魚皮明膠(fish skin gelatin, FSG) 通過水解水產(chǎn)魚皮的膠原蛋白而獲得，是相對(duì)分子質(zhì)量較高的優(yōu)質(zhì)海洋源蛋白質(zhì)[3]，其來源廣泛、價(jià)格低廉，且可有效解決哺乳動(dòng)物源明膠涉及的傳染病(瘋牛病)與宗教信仰等問題。FSG具有很高的表面活性，可以起到乳化劑的作用，并形成帶正電荷的液滴，在食品工業(yè)中被廣泛用作穩(wěn)定劑。海藻酸鈉(sodium alginate, Alg)是從褐藻或馬尾藻中提取的天然陰離子線性多糖，具有無毒、親水性、生物相容性、較強(qiáng)粘稠性等特點(diǎn)[4]，是復(fù)合體系中理想的多糖穩(wěn)定劑。SILVA等[5]將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Alg與1.5%的明膠混合，二者通過靜電作用形成復(fù)合體系，275 W超聲處理后可得到穩(wěn)定的乳液體系，提高了乳液的貯藏穩(wěn)定性。SILVANA等[6]研究了乳清分離蛋白與Alg復(fù)合制備的多層乳液，發(fā)現(xiàn)Alg的添加使得乳清蛋白通過靜電作用與Alg在油水界面結(jié)合，增加了乳液的穩(wěn)定性。雖然Alg與動(dòng)物源蛋白的相互作用研究比較廣泛，但其與海洋蛋白(如FSG)的相互作用關(guān)系還不明確。

本實(shí)驗(yàn)研究了pH、Alg濃度對(duì)FSG-Alg間相互作用的影響，通過濁度、電位、熒光光譜、冷場(chǎng)掃描電鏡、等溫滴定量熱分析了復(fù)合體系中FSG與Alg的相互作用力的類型及規(guī)律。為海洋源蛋白FSG在食品領(lǐng)域的應(yīng)用例如復(fù)合凝膠、多層乳液輸送體系等提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究了pH、Alg濃度對(duì)FSG-Alg間相互作用的影響,通過濁度、電位、熒光光譜、冷場(chǎng)掃描電鏡、等溫滴定量熱分析了復(fù)合體系中FSG與Alg的相互作用力的類型及規(guī)律。為海洋源蛋白FSG在食品領(lǐng)域的應(yīng)用例如復(fù)合凝膠、多層乳液輸送體系等提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚皮明膠,美國(guó)Sigma-Aldrich公司;玉米油,山東西王食品有限公司;海藻酸鈉、異硫氰酸熒光素,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;尼羅紅,上海生工生物工程有限公司;其他試劑均為分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer 3000HSA激光粒度儀,英國(guó)馬爾文儀器公司;Affinity等溫滴定量熱儀,美國(guó)TA儀器有限公司;F—2700熒光光譜儀,日立儀器(上海)有限公司;SU8010冷場(chǎng)掃描電鏡,日本HITACHI公司;UV2100紫外可見分光光度計(jì),上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 FSG-Alg復(fù)合體系的制備

分別取一定量的FSG和Alg于去離子水中,在室溫下用磁力攪拌器攪拌過夜,使二者可以完全水化溶解。將溶解好的溶液按一定比例混合,制備總濃度為1%,FSG及Alg的質(zhì)量比分別為8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4的混合物。用1 mol/L NaOH溶液和HCl溶液調(diào)節(jié)混合物的pH,使其pH變化區(qū)間為2～8。取一定量的上述混合物溶液于螺口玻璃瓶中,靜置12 h后進(jìn)行拍照觀察。

1.3.2 FSG-Alg復(fù)合體系的濁度測(cè)定

參照MARTINIS等[7]的方法略加修改。將樣品放置于1 cm光程的樣品池中,使用紫外分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)量樣品的濁度,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取平均值。濁度(T)定義按公式(1)計(jì)算：

T=-ln(I/I0)

(1)

式中：I,透射光強(qiáng)度;I0,入射光強(qiáng)度。

1.3.3 FSG-Alg復(fù)合體系的電位測(cè)定

Zeta電位的測(cè)定參照GUMUS等[8]的方法稍加修改。采用激光粒度儀對(duì)其Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)具體參數(shù)為：25 ℃;平衡時(shí)間10 s;運(yùn)行次數(shù):10次。

1.3.4 FSG-Alg復(fù)合體系的熒光光譜分析

采用熒光光譜儀對(duì)FSG-Alg復(fù)合體系進(jìn)行內(nèi)源熒光分析。實(shí)驗(yàn)具體參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm;采集范圍250～450 nm;掃描速率50 nm/min。

1.3.5 FSG-Alg復(fù)合體系的等溫滴定量熱(isothermal titration calorimetry,ITC)分析

復(fù)合體系的ITC分析是根據(jù)LI等[9]的方法并稍加改動(dòng)。首先,將濃度分別為0.1 mmol/L的FSG溶液與0.005 mmol/L的Alg溶液進(jìn)行脫氣處理。向樣品池中添加250 μL的Alg溶液,進(jìn)樣針吸取200 μL的FSG溶液后,對(duì)樣品進(jìn)行熱力學(xué)分析,pH 7的磷酸鹽緩沖液為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)具體參數(shù)為：實(shí)驗(yàn)溫度25 ℃;每次進(jìn)樣量5 μL;滴定次數(shù)30次;滴定間隔240 s;攪拌速率100 r/min。

1.3.6 FSG-Alg復(fù)合體系的微觀結(jié)構(gòu)觀察

使用冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡(cryo-scanning electron microscope,cryo-SEM)表征各消化階段樣品的微觀結(jié)構(gòu)。將載有樣品的樣品臺(tái)在液氮中快速冷凍至-180 ℃,將冷凍的樣品在真空條件下轉(zhuǎn)移至制備室。樣品于-90 ℃下升華20 min以去除水分。對(duì)樣品噴金處理后,在2 kV的加速電壓下操作以獲得FSG-Alg復(fù)合體系的cryo-SEM圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均至少做3次平行并取平均值,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析,P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSG-Alg復(fù)合體系的濁度變化及相行為研究

各個(gè)FSG-Alg復(fù)配比的復(fù)合體系的濁度隨pH變化的曲線如圖1-a所示。

復(fù)合體系有4個(gè)關(guān)鍵pH拐點(diǎn)：pHc為可溶性復(fù)合物形成,pHφ1為不溶性復(fù)合物形成,pHopt為達(dá)到最大濁度,pHφ2為不溶性復(fù)合物解離[10]。FSG-Alg復(fù)合體系的初始pH值在5附近,此時(shí)復(fù)合體系形成不可溶性復(fù)合物,即pHφ1。繼續(xù)增加pH,體系濁度減小,在pH 6～7時(shí)達(dá)到最小值,形成可溶性復(fù)合物,即pHc。由于Alg遇酸會(huì)形成沉淀,所以除FSG∶Alg為8∶1外,在加入酸后均在pH 4時(shí)達(dá)到最大濁度,形成不可溶性復(fù)合物,即pHopt。FSG∶Alg為8∶1時(shí)未達(dá)到最大濁度的原因可能是Alg在體系中占比較小,FSG占據(jù)主導(dǎo)作用。繼續(xù)減小pH,樣品濁度開始減小,FSG-Alg復(fù)合體系濁度的結(jié)果與其相行為宏觀圖像(圖1-b)相對(duì)應(yīng)。散射理論表明,復(fù)合體系濁度減少則體系內(nèi)顆粒減少[11]。當(dāng)FSG-Alg比例在8∶1～1∶1,不可溶性復(fù)合物在pH 2時(shí)解離,即pHφ2,體系內(nèi)顆粒減少,FSG-Alg的復(fù)合體系澄清透明。當(dāng)FSG-Alg比例為1∶2和1∶4時(shí),復(fù)合體系的濁度隨著pH的降低而升高,說明在這2種濃度下復(fù)合體系結(jié)合的更為牢固,并未出現(xiàn)復(fù)合物解離的現(xiàn)象,pH的下降使得復(fù)合體系穩(wěn)定性更好。FSG-Alg復(fù)配比例為1∶4時(shí),其濁度在pH下降過程中明顯小于FSG-Alg復(fù)配比為1∶2的濁度,這可能是因?yàn)锳lg的濃度過高超過了蛋白能夠結(jié)合的多糖臨界濃度[12],過量的Alg降低了體系的pH穩(wěn)定性,使?jié)岫冉档?。結(jié)合上述理論分析,FSG-Alg復(fù)合體系在pH 7時(shí)出現(xiàn)可溶性復(fù)合物并呈共溶趨勢(shì),并且在 FSG與Alg的配比為1∶2時(shí),體系的穩(wěn)定性受pH變化影響較小。

a-FSG-Alg復(fù)合體系的濁度曲線與pH關(guān)系;b-宏觀相行為變化圖1 FSG-Alg復(fù)合體系的濁度曲線與pH關(guān)系及宏觀相行為變化Fig.1 Turbidity curve and pH relationship,and macroscopic phase behavior change of FSG-Alg composite system

2.2 FSG-Alg復(fù)合體系的電位變化

如圖2-a所示,當(dāng)pH 7時(shí)FSG帶溫和的正電荷,Alg帶強(qiáng)的負(fù)電荷,復(fù)合體系帶負(fù)電,隨著復(fù)合體系中Alg比例的加大,其Zeta電位的絕對(duì)值發(fā)生顯著性升高(P<0.05),FSG-Alg的復(fù)配比從8∶1變化到1∶2的過程中,體系的電位從(-16.77±0.76)mV降低到(-60.70±2.52)mV。這與牛付閣[13]研究的卵白蛋白-阿拉伯膠復(fù)合體系的電位變化趨勢(shì)相同,隨著陽離子蛋白濃度增加,電位趨于正值,Alg和FSG所帶的相反的電荷相互中和導(dǎo)致電位下降。由于Alg本身是一種陰離子多糖,當(dāng)Alg濃度增大時(shí),體系所帶的負(fù)電荷逐漸增加,這說明二者之間存在一種交互作用使其形成一種新的FSG-Alg復(fù)合物。當(dāng)FSG∶Alg的復(fù)配比由1∶2增加到1∶4,電位沒有明顯的變化,這說明Alg與FSG的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和,繼續(xù)添加Alg并不會(huì)對(duì)復(fù)合體系產(chǎn)生影響。

a-pH 7;b-pH 4圖2 FSG和Alg的配比對(duì)復(fù)合體系Zeta電位的影響Fig.2 Influence of the ratio of FSG and Alg on Zeta potential

其次,由于多糖含量過高,架橋絮凝和損耗絮凝的作用會(huì)導(dǎo)致體系中分子間的復(fù)合受到抑制。

如圖2-b所示,pH為4時(shí),FSG-Alg的復(fù)配比從8∶1變化到4∶1后電勢(shì)絕對(duì)值從(1.14±0.04)mV增大到(18.84±0.12) mV,說明體系在加入Alg后趨于穩(wěn)定。值得一提的是FSG-Alg的復(fù)配比從2∶1增加到1∶2時(shí),電位由正轉(zhuǎn)為負(fù),這可能是由于Alg的酸敏感性,在pH 4時(shí)部分的Alg會(huì)形成沉淀。濁度的結(jié)果也表明,在pH 4時(shí),由于Alg沉淀的顆粒更大,FSG-Alg的復(fù)配比在2∶1～1∶1的樣品濁度顯著高于其余樣品。當(dāng)FSG-Alg的復(fù)配比例在2∶1～1∶1時(shí),Alg并未與FSG結(jié)合形成復(fù)合物,未結(jié)合的FSG導(dǎo)致了體系整體電位為正。繼續(xù)增加Alg,當(dāng)FSG-Alg的復(fù)配比達(dá)到1∶2和1∶4時(shí)溶液體系電位的絕對(duì)值最高(>50 mV),這可能是因?yàn)镕SG分子上的正電荷與Alg分子上的負(fù)電集團(tuán)發(fā)生靜電吸引[14],使得復(fù)合體系的電勢(shì)增加。

2.3 FSG-Alg復(fù)合體系的熒光光譜變化

蛋白質(zhì)的某些氨基酸,如色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基會(huì)由于復(fù)合體系中蛋白質(zhì)與多糖之間的相互作用而發(fā)生改變。通常根據(jù)內(nèi)源性熒光強(qiáng)度來分析其周圍環(huán)境的極性狀況以及相互作用的類型[15]。由圖3可知,隨著Alg的加入,熒光光譜的峰值未發(fā)生較大的偏移,說明Alg沒有使FSG的酪氨酸和色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生太大的變化[16]。

pH為4時(shí),FSG-Alg的復(fù)配比為8∶1時(shí)體系的熒光強(qiáng)度最低,體系中的多糖濃度增加后,其熒光強(qiáng)度有所增加,可能是蛋白質(zhì)發(fā)生了自聚集與Alg相互作用后使發(fā)色基團(tuán)被包裹在其他大分子側(cè)鏈內(nèi),使熒光強(qiáng)度增加[17]。說明體系中的FSG-Alg復(fù)合物并非穩(wěn)定,而是以團(tuán)聚體的形式存在,并且隨著Alg濃度上升,團(tuán)聚更加明顯,當(dāng)FSG-Alg的復(fù)配比為2∶1時(shí),體系中的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值,表明此時(shí)體系的濁度最大,與濁度曲線(圖1-a)吻合。

a-pH 4;b-pH 7圖3 FSG和Alg的配比對(duì)復(fù)合體系熒光光譜的變化Fig.3 Effect of the ratio of FSG to Alg on the fluorescence spectrum of FSG-Alg composite system

pH為7時(shí),FSG-Alg的復(fù)配比為8∶1時(shí)體系的熒光強(qiáng)度最高,并且隨著Alg比例的增加,體系的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。這說明Alg的增加對(duì)熒光有猝滅效果[18],Alg與FSG發(fā)生了相互作用,Alg改變了FSG的空間構(gòu)象。當(dāng)FSG與Alg配比達(dá)到1∶2后,增加Alg濃度,體系的熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生大的轉(zhuǎn)變,結(jié)合之前的濁度與電位結(jié)果可知,多余的Alg游離在體系中,并未與FSG結(jié)合。薛瑾等[19]在研究茶多酚與酪蛋白的相互作用時(shí)也出現(xiàn)了類似的情況。蛋白與多糖間的相互作用會(huì)導(dǎo)致熒光猝滅致使熒光強(qiáng)度下降。在熒光猝滅機(jī)理的研究過程中,蛋白質(zhì)通常是作為熒光能量的供體,這些熒光供體與其他物質(zhì)(熒光猝滅劑即熒光能量受體)存在分子間的弱相互作用力,主要包括靜電作用力、范德華力、疏水作用力和氫鍵等[20]。

2.4 FSG-Alg復(fù)合體系的ITC分析

濁度結(jié)果表明,pH 4時(shí)所有比例的FSG-Alg溶液均形成不可溶沉淀,故僅對(duì)pH 7條件下FSG-Alg體系進(jìn)行等溫滴定量熱測(cè)定。根據(jù)OVERBEEK等[21]的理論,蛋白質(zhì)和多糖的復(fù)合受靜電作用和熱力學(xué)作用的影響,與溶劑分子電荷相反的粒子結(jié)合成凝聚相,包埋了溶劑分子。由于分子重排的影響,凝聚相中溶劑分子的存在增加了體系的熵值。為了進(jìn)一步了解FSG與Alg的熱力學(xué)相互作用,等溫滴定量熱法的結(jié)果如圖4所示。

圖4 FSG與Alg的等溫滴定曲線Fig.4 Isothermal titration curves of FSG and Alg

在pH 7時(shí),在Alg滴定FSG過程中的焓變值始終為負(fù)(ΔH<0),說明FSG與Alg間的復(fù)合反應(yīng)是放熱反應(yīng),并且是自發(fā)的(ΔG<0)。這個(gè)結(jié)果與已報(bào)道的復(fù)合物形成主要是由靜電相互作用引起的觀點(diǎn)相吻合[22]。在pH 7下FSG與Alg所帶電荷相反,兩者之間由靜電吸引產(chǎn)生的靜電作用力,釋放出了較多熱量。隨著Alg的滴定量增加,體系的焓變值不斷減小趨于穩(wěn)定。在FSG∶Alg=1∶2時(shí)出現(xiàn)滴定終點(diǎn),繼續(xù)滴加Alg并不會(huì)引起熱量的變化,說明體系中FSG與Alg完全結(jié)合,沒有更多的結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生靜電作用而放熱,因此體系的滴定熱會(huì)逐漸降低。整個(gè)熱力學(xué)相互作用過程中,體系的焓變值為(-23.24±2.49)kJ/mol,熵變值為(36.93±0.08)kJ/mol。孫亞天等[23]研究了pH 6時(shí)大豆蛋白與殼聚糖滴定的熱量變化。在焓變過程中隨著殼聚糖濃度的增加,放熱量逐漸降低直至最終體系穩(wěn)定。表明FSG和Alg的熱力學(xué)作用為靜電作用和負(fù)焓驅(qū)動(dòng)的放熱反應(yīng),且在當(dāng)FSG∶Alg=1∶2時(shí)達(dá)到焓變最大值。

2.5 FSG-Alg復(fù)合體系的空間結(jié)構(gòu)觀察

如圖5所示,pH 4和pH 7條件下的FSG-Alg復(fù)合體系的微觀結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別：pH 4時(shí)復(fù)合體系呈細(xì)絲狀堆疊的結(jié)構(gòu),并沒有穩(wěn)定完整的空間構(gòu)象,結(jié)合濁度的結(jié)果可知,由于Alg在酸性條件下產(chǎn)生沉淀,體系中蛋白與多糖間的靜電作用也相對(duì)較小,并且隨著Alg濃度增加,最終形成與pH 4時(shí)單純Alg溶液相似的片層狀的結(jié)構(gòu),表明此時(shí)Alg并沒有充分與FSG復(fù)合,復(fù)合體系相對(duì)不穩(wěn)定。

圖5 FSG和Alg的配比對(duì)復(fù)合體系空間結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Influence of the ratio of FSG to Alg on the spatial structure of the composite system

在pH 7時(shí)Alg的片層結(jié)構(gòu)較為平滑,有形成蜂窩狀的趨勢(shì),而FSG的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)細(xì)碎枝杈狀的結(jié)構(gòu)。如圖5所示,當(dāng)FSG∶Alg>1∶1時(shí),并沒有呈片層狀結(jié)構(gòu),當(dāng)FSG∶Alg=1∶1和1∶2時(shí),復(fù)合體系微觀結(jié)構(gòu)呈片層狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)FSG∶Alg=1∶4時(shí),又呈與單純Alg相似的蜂窩狀結(jié)構(gòu)。這說明當(dāng)FSG和Alg混合后,隨著Alg濃度增加,FSG特有的枝杈狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在Alg的片層上,表明FSG-Alg結(jié)合形成了穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。當(dāng)FSG∶Alg=1∶1和1∶2時(shí),復(fù)合物中親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的比例接近0.5。MAI等[24]和BATES等[25]的研究結(jié)果同樣表明,當(dāng)復(fù)合物中單體分子數(shù)量/整體聚合度為0.4～0.6時(shí),兩親性小分子物質(zhì)在水中會(huì)自組裝呈片層狀。所以當(dāng)FSG∶Alg=1∶1和1∶2時(shí),復(fù)合體系呈穩(wěn)定的片層狀,繼續(xù)增加Alg的濃度,過量的Alg堆積形成蜂窩狀結(jié)構(gòu),影響復(fù)合體系的穩(wěn)定以及FSG與Alg間的相互作用。

3 結(jié)論

本研究在不同pH條件下制備了不同F(xiàn)SG、Alg配比的蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合體系。對(duì)復(fù)合體系進(jìn)行濁度、Zeta電位、熒光光譜和ITC測(cè)定發(fā)現(xiàn)：FSG-Alg復(fù)合體系在pH 7時(shí)共溶,在此pH下FSG-Alg的結(jié)合是最穩(wěn)定的;FSG-Alg復(fù)合體系中靜電作用占據(jù)主導(dǎo),靜電作用隨著Alg濃度的增加而更加強(qiáng)烈,在FSG∶Alg為1∶2時(shí)復(fù)合體系的電荷量最高,FSG與Alg間的靜電作用最強(qiáng),pH是影響靜電作用的主要因素。冷場(chǎng)掃描電鏡觀察到FSG與Alg在靜電力的作用下緊密結(jié)合,隨著Alg濃度的升高,Alg細(xì)絲更多的附著在FSG的枝杈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。不同的是pH 7時(shí)FSG與Alg復(fù)合體系形成了更為穩(wěn)定的蜂窩狀結(jié)構(gòu),而pH 4時(shí)則呈片層狀結(jié)構(gòu),表明pH 7時(shí)FSG與Alg間的靜電作用更強(qiáng)。本研究對(duì)FSG和Alg相互結(jié)合的規(guī)律進(jìn)行了初步探索,為今后的復(fù)合納米粒子或多層乳液制備提供了理論研究基礎(chǔ)。