王歡 張雨霖 許育絢 丁禹

耳聾是一種常見的疾病，嚴(yán)重困擾人類的生活。有研究顯示，每1,000個(gè)新生兒中有1～3例聽力障礙，且約30%成年人在＞65歲出現(xiàn)明顯的聽力下降［1-2］。遺傳因素和環(huán)境因素均可以引起聽力下降，其中約50%耳聾由遺傳因素引起［3］，遺傳方式可表現(xiàn)為常染色體顯性、常染色體隱性、X-連鎖和母系遺傳等［4］。母系遺傳中，線粒體12S rRNA基因是氨基糖甙類抗生素（aminoglycoside antibiotics，AmAn）導(dǎo)致的非綜合征型聽力損失的一個(gè)突變熱點(diǎn)區(qū)域。其中，位于12S rRNA高度保守解碼區(qū)的A1555G和C1494T突變與耳聾相關(guān)，可導(dǎo)致較多患者對(duì)AmAn敏感［5］。除了12S rRNA基因外，線粒體tRNA（mitochondrial tRNA，mt-tRNA）也是耳聾相關(guān)的突變熱點(diǎn)區(qū)域，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，tRNASer（UCN）A7445G［6］，tRNAIle A4317G［7］，tRNAThrG15927A［8］突變和耳聾有關(guān)。本研究分析2個(gè)攜帶線粒體12S rRNA A1555G突變的聾病家系，并對(duì)其做了臨床和分子遺傳學(xué)的評(píng)估。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本課題組前期收集耳聾患者213例，其中男108例，女105例；年齡21～76歲，中位年齡45歲。正常對(duì)照120例，其中男66例，女54例，年齡19～55歲，中位年齡39歲。本項(xiàng)目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 線粒體12S rRNAA1555G突變篩查 將患者樣本統(tǒng)一編號(hào)，數(shù)據(jù)錄入后提取基因組DNA。使用大連寶生物有限公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 4.0試劑盒提取基因組DNA，并進(jìn)行濃度和純度的鑒定。對(duì)有些低濃度、純度的樣本在1.5%瓊脂糖凝膠（EB濃度為0.5 μg/mL）上電泳，進(jìn)一步驗(yàn)證基因組DNA是否提取成功。使用以下引物擴(kuò)增12S rRNA基因：正向：5'-CGATCAACCTCACCACCTCT-3'；反向：5'-TGGACAACCAGCTATCACCA-3'，PCR后取5 μL的產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，送華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAstar和Chromas 2.0軟件與校正后的人類線粒體劍橋參考序列（revised Cambridge Reference Sequence，rCRS，GenBank Accession Number：NC_012920.1）［9］比對(duì)，讀取12S rRNA變異結(jié)果。

1.3 2個(gè)攜帶線粒體A1555G突變的家系分析 經(jīng)過詳細(xì)的遺傳咨詢，鑒定了2個(gè)母系遺傳的耳聾家系（SXD-10；SXD-15），見圖1。耳聾患者經(jīng)過紹興市柯橋區(qū)婦幼保健院耳鼻喉科門診的詳細(xì)病史調(diào)查和體格檢查，以確定是否有綜合征性耳聾的臨床表現(xiàn)，是否有AmAn的使用史以及是否有其他致聾的環(huán)境因素。其中聽力學(xué)檢查包括純音測(cè)聽（pure tone audiometry，PTA）、聽覺腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）、聲阻抗以及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（distortion product otoacoustic，DPOAE），純音測(cè)聽以聽力水平的分貝（dB）值為單位進(jìn)行測(cè)量，并以頻率500、1,000、2,000、4,000、8,000 Hz的聽閾平均值計(jì)算，將聽力損失的嚴(yán)重程度分成5級(jí)，正常＜25 dB，輕度聾25～40 dB，中度聾＞ 40～60 dB，重度聾＞60～90 dB，極重度聾＞90 dB［10］。

圖1 2個(gè)攜帶線粒體A1555G突變的聾病家系，箭頭所指的是先證者

1.4 線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變篩查 對(duì)2個(gè)家系的母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）進(jìn)行基因組DNA提取，使用24對(duì)引物進(jìn)行線粒體基因組的PCR擴(kuò)增［11］。對(duì)全部PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果和rCRS比對(duì)，判斷變異位點(diǎn)。

1.5GJB2基因突變篩查 使用正向引物：5'-TATGACACTCCCCAGCACAG-3'；反 向 引 物：5'-GGGCAATGCTTAAACTGGC-3'對(duì)母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）進(jìn)行GJB2基因的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化后送至華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GJB2基因的標(biāo)準(zhǔn)序列［12］進(jìn)行比對(duì)，篩選突變位點(diǎn)（GenBank Accession Number：M86849）。

2 結(jié)果

2.1 線粒體A1555G突變篩查 對(duì)213例耳聾患者和120例正常對(duì)照個(gè)體進(jìn)行線粒體A1555G突變篩查。首先擴(kuò)增線粒體12S rRNA基因，隨后進(jìn)行Sanger測(cè)序分析，共鑒定了2個(gè)攜帶A1555G突變的個(gè)體，但該突變?cè)谡?duì)照個(gè)體中未被發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過對(duì)先證者詳細(xì)的遺傳咨詢后，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)家系具有較為明顯的母系遺傳。見圖2。

圖2 線粒體A1555G突變鑒定：A. 線粒體12S rRNA基因PCR擴(kuò)增電泳圖；B. 線粒體A1555G突變測(cè)序鑒定

2.2 2個(gè)攜帶線粒體A1555G突變家系的臨床資料 這2個(gè)家系主要生活在紹興市柯橋區(qū)，在SXD-10家系中，先證者（II-8），女，61歲，從小有AmAn的用藥史，劑量不明。用藥后雙耳聽力下降，純音測(cè)聽，聲阻抗，ABR等臨床檢測(cè)提示雙側(cè)極重度耳聾，其中右耳的PTA為90 dB，左耳的PTA為80 dB。先證者的2個(gè)弟弟（II-3和II-5）也有不同程度的聽力損失，其中II-3還有AmAn的用藥史。先證者的兒子（III-5）也是耳聾患者，右耳的PTA為55 dB，左耳的PTA為75 dB。該家系共3代15人，母系成員共6人，患病人數(shù)4人，耳聾的外顯率為66.7%。其他成員聽力正常，無糖尿病、心血管疾病、視覺障礙等其他疾病。在SXD-15家系中，先證者（III-9），女，35歲，聽力檢測(cè)提示右耳和左耳的PTA均為80 dB，屬于重度耳聾。經(jīng)過詳細(xì)的遺傳咨詢，發(fā)現(xiàn)先證者的哥哥（III-6），母親（II-6），姨媽（II-4）和外婆（I-2）均為耳聾患者，其中II-4和II-6有AmAn的用藥史，用藥劑量不詳。該家系共4代21人，母系成員8人，患病數(shù)5人，耳聾的外顯率為62.5%。家系的其他成員聽力正常，無糖尿病、心血管疾病、視覺障礙等其他疾病，見表1。

表1 兩個(gè)攜帶線粒體A1555G突變的耳聾家系母系成員臨床資料

2.3 線粒體基因組的突變分析 對(duì)這2個(gè)家系的母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）的線粒體基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序分析，見表2。發(fā)現(xiàn)在D-Loop區(qū)含有14個(gè)變異位點(diǎn)，在12S rRNA上有5個(gè)突變位點(diǎn)，16S rRNA上有3個(gè)突變位點(diǎn)，在tRNAThr上有2個(gè)突變位點(diǎn)（A15924G和G15927A），其余的突變主要集中在蛋白編碼區(qū)，其中錯(cuò)義突變共有7個(gè)：ND2 C5178A（Leu→Met）和A5301G（Ile→Val），A8 C8414T（Leu→Phe），A6 A8701G（Thr→Ala）和A8860G（Thr→Ala），ND5 G13708A（Ala→Thr），CytB A15326G（Thr→Ala）。隨后對(duì)這些變異位點(diǎn)在不同物種間（包括人、牛［13］、鼠［14］、爪蟾［15］）的mtDNA進(jìn)行種系進(jìn)化保守分析，除12S rRNA A1555G，tRNAThrA15924G和G15927A突變外，其余突變?cè)谶M(jìn)化上均不保守。

表2 兩個(gè)攜帶A1555G突變的耳聾家系母系成員線粒體基因變異匯總表

2.4GJB2基因突變篩查GJB2是導(dǎo)致遺傳性非綜合征型耳聾最常見的基因［16］。對(duì)這2個(gè)家系的母系成員（SXD-10：II-3，II-5，II-8和III-5；SXD-15：I-2，II-4，II-6，III-6和III-9）進(jìn)行GJB2基因突變篩查，在這兩個(gè)家系中并未發(fā)現(xiàn)GJB2基因的突變位點(diǎn)，提示GJB2在耳聾的表型表達(dá)中并不起作用。

3 討論

本研究首先對(duì)213例耳聾患者和120例正常對(duì)照個(gè)體進(jìn)行線粒體A1555G突變的篩查，經(jīng)過測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)有2個(gè)耳聾患者攜帶A1555G突變。當(dāng)發(fā)生A1555G突變時(shí)，線粒體核糖體A位形成了一個(gè)新的1494C-G1555堿基配對(duì)，使得12S rRNA基因在二級(jí)結(jié)構(gòu)上與E.coil16S rRNA相應(yīng)解碼區(qū)更加相似，從而增強(qiáng)AmAn藥物在12S rRNAA位的結(jié)合力［17］。轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞系生化功能研究發(fā)現(xiàn)：A1555G突變可以導(dǎo)致線粒體功能障礙，且對(duì)AmAn具有超敏性［18］。在無AmAn存在時(shí)，攜帶A1555G突變的家系母系成員在外顯率、聽力損失程度和發(fā)病年齡方面存在較大差異，表明A1555G突變本身尚不足以造成耳聾，其他修飾因子如AmAn、線粒體單倍型和核修飾基因等可能參與調(diào)節(jié)耳聾的外顯率和表型表達(dá)［19］。

對(duì)2個(gè)攜帶A1555G突變的耳聾家系進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)家系中患者僅表現(xiàn)為聽力障礙單一的臨床癥狀，且呈現(xiàn)典型的母系遺傳特征，提示耳聾的發(fā)病與mtDNA突變有關(guān)。對(duì)先證者和母系成員的線粒體基因組突變分析后發(fā)現(xiàn)，存在A1555G突變和tRNAThr突變（A15924G和G15927A），分別屬于東亞線粒體單體型B4c1和B5b1［20］。從結(jié)構(gòu)上看（見圖3），A15924G和G15927A突變均發(fā)生在tRNAThr的反密碼子環(huán)上，其中A15924G突變破壞了原有的（29T-37A）Watson-Crick堿基配對(duì)，而G15927A突變破壞了原有高度保守的（26C-40G）的堿基配對(duì)。A15924G突變被報(bào)道和線粒體腦肌病有關(guān)［21-22］，而G15927A突變被報(bào)道和冠心?。?3］、Leber視神經(jīng)病變有關(guān)［24］。轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：G15927A突變顯著降低tRNAThr的穩(wěn)定性和氨基?；剑?5］。因此，線粒體A15924G和G15927A突變通過改變tRNAThr的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致tRNA代謝紊亂，使得線粒體蛋白合成受阻，加劇A1555G突變引起的線粒體功能障礙，是耳聾有關(guān)的繼發(fā)性突變位點(diǎn)。由于并未篩查到GJB2基因任何有意義的突變位點(diǎn)。因此，在這2個(gè)家系中，線粒體tRNAThrA15924G和G15927A突變可能是影響耳聾表型表達(dá)的重要因素。對(duì)有耳聾家族史的個(gè)體，早期篩查mtDNA突變是有必要的，這為降低耳聾的發(fā)病率，預(yù)防藥物性耳聾具有重要的臨床意義。

圖3 線粒體A15924G和G15927A突變所在的tRNAThr基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，箭頭所指的是A15924G和G15927A突變的位置