戴順 沈瑞林 唐晨野 汪家盛 郭曉

丹參酮類(lèi)化合物又稱(chēng)總丹參酮，是從唇形科植物丹參干燥后的根和根莖中提取的一大類(lèi)脂溶性菲醌類(lèi)化合物。丹參酮是其中一種所含丹參含量最高的一種成分，不僅對(duì)能夠保護(hù)人體心血管與神經(jīng)細(xì)胞、改善血液微循環(huán)、抵抗慢性肝血管纖維化以及能夠誘導(dǎo)體內(nèi)干擾素細(xì)胞功能發(fā)生良性分化等均具有重要的保護(hù)作用［1］，還具有良好的抗腫瘤活性［2］。前期臨床研究顯示，丹參酮ⅡA 在體外免疫作用中可以有效抑制人體惡性膀胱癌J82細(xì)胞的體外增殖，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，且同時(shí)降低體外侵襲及細(xì)胞遷移時(shí)的性能，具有多方面的抗膀胱癌作用［3］。本研究初步探討丹參酮ⅡA抗膀胱癌作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要材料 （1）膀胱癌細(xì)胞株來(lái)源：人膀胱癌J82細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）。（2）主要材料：培養(yǎng)基（DMEM）（貨號(hào)SH30022.01B，美國(guó)Hyclone公司），F(xiàn)BS（貨號(hào)S601S-500，德國(guó)Sera & Pro公司），丹參酮ⅡA（貨號(hào)T4952-5MG，美國(guó)Sigma公司），0.25%Trypsin-EDTA細(xì)胞消化液（貨號(hào)0457，美國(guó)Amresco公司），青霉素-鏈霉素雙抗混懸液（貨號(hào)15140-122，美國(guó)Gibco公司），PBS緩沖液（美國(guó)Sigma公司），牛血清蛋白（BSA）粉劑（美國(guó)Abcam公司），丙烯酰胺40%溶液、SDS、TEMED（美國(guó)Thermo Fisher公司），甘氨酸、Tris base（美國(guó)Amresco公司），SDS（美國(guó)VWR公司），PNPP（美國(guó)Biolab 公司），APS（美國(guó)VWR公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、Annexin V-FITC/碘化丙錠（PI）（日本同仁化學(xué)研究所），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore公司）。（3）主要抗體：β-actin抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司），caspase 3抗體、caspase 9抗體（美國(guó)CST）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將人膀胱癌J82細(xì)胞體外培養(yǎng)，均使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM（高糖）培養(yǎng)基，將其置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞半數(shù)抑制率（IC50）的測(cè)定：①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)方式，按2,000～4,000個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，每孔加150μL，設(shè)置藥物濃度分別為1、2、3、5、8 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（過(guò)夜貼壁），邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。②細(xì)胞培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞貼壁完全且穩(wěn)定生長(zhǎng)后對(duì)其進(jìn)行加藥處理。在實(shí)驗(yàn)組中每孔加入相應(yīng)濃度藥物10μL，陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組每孔加入10μL DMEM培基。③置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，混勻后再孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光吸收值（OD值）。增殖抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。采用Graphpad Prism軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）并繪圖。（2）CCK-8法檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞增殖的影響：①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)方式，按2,000～4,000個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，每孔加150μL。設(shè)置不加藥物的空白組和加IC50范圍濃度的丹參酮ⅡA藥物處理組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)鋪孔5天，邊緣孔以及天數(shù)間用無(wú)菌PBS填充。②將96孔板搖晃混勻，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天同一時(shí)間加入10μL CCK-8試劑，混勻后再孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光吸收值（OD值）。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞，分別用不同濃度（1、3μmol/L）的丹參酮ⅡA藥作用于細(xì)胞，另設(shè)一組對(duì)照組，更換不含藥物的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)是否良好，將各組細(xì)胞通過(guò)無(wú)菌PBS清洗、0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞離心制成細(xì)胞懸液，經(jīng)甲醇固定過(guò)夜，PBS清洗3次加入適量的Annexin V-FITC溶液與PI染色液共孵育30 min，混勻后轉(zhuǎn)移至上樣管，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期情況。（4）免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白及p65蛋白的表達(dá)情況：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞分別用含1、3μmol/L藥物及不含藥物的培養(yǎng)基（對(duì)照組）處理培養(yǎng)48 h，吸盡舊液，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來(lái)，加入細(xì)胞裂解液（100 μL RIPA、1μL PMSF）提取總蛋白（冰上操作，以防蛋白降解），用BCA蛋白定量法測(cè)定總蛋白濃度并計(jì)算上樣量，保持內(nèi)參一致。經(jīng)SDS-PAGE電泳，濃縮膠80 V，至分離膠時(shí)改電壓為120 V，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，70 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗稀釋液，4℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗滌5min×3次，再加二抗稀釋液，室溫避光孵育1 h，TBST避光洗滌5min×3次。進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光曝光、顯影。對(duì)感光膠片條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示。組間整體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonfferoni校正法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA抑制J82細(xì)胞增殖 OD值可反映細(xì)胞增殖活力 丹參酮ⅡA處理J82細(xì)胞48 h后，各組450 nm OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=346.35，P＜0.001），1μmol/L組與陰性對(duì)照組比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余不同濃度兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮ⅡA作用J82細(xì)胞48 h的IC50為4.16μmol/L。各藥物處理組增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=293.68，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。確定IC50值后，設(shè)置空白對(duì)照組和藥物處理組，分別作用于J82細(xì)胞，CCK-8法測(cè)定其1、2、3、4、5 d的增值情況，根據(jù)受測(cè)細(xì)胞的吸光度值，繪制成細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。見(jiàn)圖2。藥物處理組細(xì)胞增殖速率明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 丹參酮ⅡA的濃度對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響

表1 不同濃度組間450 nm OD值及細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

表1 不同濃度組間450 nm OD值及細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

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圖1 丹參酮ⅡA的J82細(xì)胞增殖半數(shù)抑制率的測(cè)定

2.2 丹參酮ⅡA阻滯J82細(xì)胞周期 對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組 的G1期 細(xì) 胞 百 分 比 值分 別 為（42.22%±0.48%）、（47.98%±1.49%）、（54.94%±3.39%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.15，P＜0.05），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；S期細(xì)胞百分比分別為（46.32%±2.14%）、（39.72%±2.88%）、（33.19%±4.17%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.21，P＜0.05），但差異主要存在于3μmol/L組與對(duì)照組（P＜0.05）；G2期細(xì)胞百分比分別為（14.46%±2.17%）、（13.21%±2.83%）、（9.87%±0.95%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.71，P＞0.05）。見(jiàn)圖3～4。

圖3 三組J82細(xì)胞周期流式檢測(cè)結(jié)果

圖4 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞周期的影響

2.3 丹參酮ⅡA誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組、5μmol/L組的細(xì)胞數(shù)分別為7,787、10,106、9,502、14,941個(gè)；總凋亡率分別為3.36%、12.23%、14.74%、18.40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1,028.98，P＜0.001）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，3個(gè)藥物處理組的總凋亡率均高于對(duì)照組（χ2=452.65、638.49、1,006.78，P＜0.05），3μmol/L組、5μmol/L組的總凋亡率均高于1μmol/L組（χ2=25.59、161.46，P＜0.05），5μmol/L組的總凋亡率高于3μmol/L組（χ2=55.14，P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 不同濃度丹參酮ⅡA誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)結(jié)果（Q1：機(jī)械損傷；Q2：晚期凋亡；Q3：正常細(xì)胞；Q4：早期凋亡；總凋亡=Q4+Q2）

2.4 丹參酮ⅡA促進(jìn)J82細(xì)胞中caspase 3、caspase 9蛋白的表達(dá) 對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.02、0.39±0.02、0.52±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=113.10，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；caspase 9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.02±0.02、0.17±0.03、0.34±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.83，P＜0.05），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組的 cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.02、0.12±0.03、0.05±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=113.10，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組Bcl-x蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.56±0.04、0.23±0.02、0.08±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=211.10，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組P56蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.02、0.10±0.02、0.04±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=143.20，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖6～7。

圖6 cyclin D1、Bcl-xL、caspase3、caspase9、P65蛋白在三組J82細(xì)胞中表達(dá)的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

圖7 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞cyclin D1、Bcl-xL、caspase3、caspase9、P65蛋白表達(dá)的影響

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，根據(jù)病理學(xué)分期可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscleinvasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），新發(fā)病例絕大多數(shù)為NMIBC，占70%以上。目前在膀胱癌的治療以手術(shù)為主的綜合療法已得到公認(rèn)和普及，但并未給患者的預(yù)后帶來(lái)突破性改善。NMIBC經(jīng)手術(shù)治療后聯(lián)合膀胱灌注治療，復(fù)發(fā)率仍達(dá)50%～70%，約10%～15%的患者會(huì)進(jìn)展為MIBC［4］。MIBC的治療，盡管積極采取根治性膀胱切除術(shù)及全身化療，仍有至少50%的患者在5年內(nèi)死于腫瘤轉(zhuǎn)移，其中位生存期僅為12～15個(gè)月［5］。因此，開(kāi)發(fā)新藥物或?qū)ふ夷承┚哂辛己玫目鼓[瘤活性的天然藥物，應(yīng)用于膀胱癌以減少?gòu)?fù)發(fā)，具有十分重要的意義。

研究表明，丹參酮類(lèi)化合物丹參酮ⅡA對(duì)骨肉瘤、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有良好的抗腫瘤活性［6-13］，其抗腫瘤作用表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移等諸多方面［14］。丹參酮類(lèi)化合物也可提高化療后機(jī)體的免疫功能，對(duì)機(jī)體的免疫臟器也有一定的保護(hù)作［15］。該化合物來(lái)源于中國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參，毒副作用較低，是一種具有潛在臨床應(yīng)用前景的抗腫瘤天然藥物，近年來(lái)越來(lái)越受到關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA可明顯抑制J82細(xì)胞的增殖，且抑制率隨著藥物劑量的增加而增加。這與CHIU等［16］的研究有類(lèi)似的結(jié)果，其發(fā)現(xiàn)經(jīng)丹參酮ⅡA處理后5637、BFTC、T24及TCCSUP四種膀胱癌細(xì)胞的存活率均以藥物劑量和作用時(shí)間依賴(lài)的方式顯著降低。故丹參酮ⅡA對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制作用確切。本研究顯示，丹參酮ⅡA可使J82細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯，這可能是丹參酮ⅡA抑制J82細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，其中相關(guān)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本研究還顯示，丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡，并隨著劑量的增加而凋亡率升高。以往有研究顯示，丹參酮ⅡA可通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡［17-19］，也可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、死亡受體途徑誘導(dǎo)卵巢癌、肝細(xì)胞癌凋亡［8，20］。本研究結(jié)果顯示，凋亡抑制因子cyclin D1、Bcl-xL，P65蛋白表達(dá)隨藥物濃度升高而降低，提升丹參酮ⅡA可抑制凋亡。丹參酮ⅡA可明顯增加J82細(xì)胞中caspase 3和caspase 9兩種蛋白的表達(dá)，且藥物劑量越高，蛋白表達(dá)越多，而caspase 8蛋白的表達(dá)則不受藥物影響。當(dāng)線(xiàn)粒體損傷時(shí)，線(xiàn)粒體完整性被破壞可導(dǎo)致多種促凋亡因子包括細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C與胞質(zhì)中的細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合，直接激活caspase9等［21］，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這表明丹參酮ⅡA很可能通過(guò)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡。下一步需要檢測(cè)該通路上下游的信號(hào)分子來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，丹參酮ⅡA在體外可抑制J82細(xì)胞增殖，G1/S期阻滯可能是其中的機(jī)制之一，同時(shí)丹參酮ⅡA可能通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡。本研究為丹參酮ⅡA在膀胱癌藥物治療中的應(yīng)用提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但僅為體外實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果的科學(xué)價(jià)值有待進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。