賈貝田 ，王麗 ，崔換天 ，金昱彤 ，曹敏 ，劉海朝 ，邊育紅

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192；3.山東大學，青島 266237）

細胞免疫應答是抗腫瘤免疫的主要方式[1]。有效的抗原遞呈是激活CD8+T細胞并觸發(fā)細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應的關(guān)鍵。樹突狀細胞（DCs）作為最強大的抗原呈遞細胞（APC），可以通過識別腫瘤相關(guān)抗原，激活CTL特異性殺滅腫瘤細胞，在抗腫瘤過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者的DCs功能缺陷與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]?；颊叩哪[瘤組織、淋巴結(jié)和外周血中成熟DCs的數(shù)量顯著減少，抗原呈遞和CTL激活的能力低下[4]。因此，促進DCs成熟，進而激活CTL已成為國內(nèi)外研究熱點[5]。

黃芪多糖（APS）是扶正中藥黃芪的主要活性成分，已被公認為是一種抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)劑，并在臨床上得到廣泛應用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)：APS抗腫瘤作用與DCs密切相關(guān)[8]。APS可促進DCs表面分子CD80、CD86的表達，促進DCs成熟，并激活CTL發(fā)揮抗腫瘤作用[9-11]。

Toll樣受體4（TLR4）是DCs的核心模式識別受體，通過TLR4介導的DCs活化是啟動CD8+T細胞反應的重要步驟。研究發(fā)現(xiàn)DCs可通過TLR4介導的髓樣分化因子（MyD88）依賴的信號轉(zhuǎn)導通路被LPS/中藥多糖活化，分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-12等多種細胞因子[12-13]。TLR4被配體激活后，MyD88蛋白的TIR域與TLR的TIR域結(jié)合，而后通過其死亡區(qū)域與IL-1受體相關(guān)激酶（IRAKs）的N-末端死亡區(qū)域相互作用，其中IRAK1被IRAK4磷酸化而活化，超磷酸化的IRAK1與TRAF6結(jié)合并使其活化，激活下游通路進而導致細胞質(zhì)內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）活化，促使 NF-κB 進入細胞核，激活相關(guān)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，誘導DC成熟，分泌共刺激分子及相關(guān)細胞因子。通過TLR4中和抗體抑制TLR4信號傳導或干擾TLR4可以導致細胞炎性因子產(chǎn)生的減少[14]。Priyank等[15]發(fā)現(xiàn)TLR4可以通過My D88依賴性途徑促進DCs誘導的CTL活化。但是，尚不清楚TLR4信號通路是否介導APS誘導的DCs活化并發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本實驗將以小鼠樹突狀細胞DC2.4為受試細胞，研究基于TLR4通路APS對DCs活化及發(fā)揮抗腫瘤作用影響。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠樹突狀細胞DCs 2.4購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；小鼠結(jié)腸癌細胞CT26購于上海北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；雄性BALB/c小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司；APS粉末購于天津賽諾制藥有限公司；青霉素鏈霉素混合液、RPMI-1640培養(yǎng)基、FITC標記的CD80抗體、PE標記的CD86抗體、腫瘤壞死因子（TNF）-α、0.25%胰蛋白酶、細胞總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒、Q-PCR擴增試劑盒（SYBR Green）以及ELISA相關(guān)試劑盒購于天津貝爾格萊科技有限公司；TLR4通路抑制劑ST2825、TAK-242購于MedChem Express；胎牛血清購于天津華立科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 小鼠樹突狀細胞DC2.4用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100 μg/mL鏈霉素）進行培養(yǎng)；小鼠結(jié)腸癌CT26細胞用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)箱設置條件：5% CO2、恒溫37℃、飽和濕度，每2日更換培養(yǎng)液，觀察并記錄細胞的生長狀態(tài)。

取對數(shù)生長期的DC2.4細胞，調(diào)整密度為4×105個細胞/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，具體分組如下：控制（Control） 組、APS 組、TNF-α 組、APS+TNF-α 組、TAK-242＋TNF-α 組、TAK-242＋APS＋TNF-α 組、ST2825＋TNF-α 組及 ST2825＋APS＋TNF-α 組。

1.2.2 APS對DC2.4細胞成熟及活化的影響 各分組細胞培養(yǎng)72 h后，分別收集細胞及上清，細胞流式技術(shù)檢測DC2.4細胞表面標記CD80、CD86的表達水平，ELISA試劑盒檢測上清中細胞因子IL-12p-70的分泌情況。

1.2.3 APS干預的DC2.4對T細胞活化及殺傷腫瘤的影響 1）小鼠脾臟淋巴細胞分離及染色：頸椎脫臼處死健康的BALB/c小鼠，75%的乙醇浸泡消毒，無菌取小鼠脾臟，研磨脾臟，用200目細胞篩過濾除去組織塊，收集脾臟細胞，用D-Hanks平衡鹽溶液清洗2次，加入紅細胞裂解液處理5 min，2 000 r/min離心20 min（離心半徑為17.3 cm，下同），用1mL完全培養(yǎng)基重懸，接種于T25培養(yǎng)瓶中。12 h后，收集非貼壁細胞即為脾臟淋巴細胞，1500rmp離心5min，棄上清，用PBS溶液洗兩次，每次1500rmp離心5 min，棄上清，加入已配好的CTG染液，37℃避光孵育30 min。1 500 rmp離心5 min，棄上清，用PBS溶液清洗一次，1 500 rmp離心5 min，棄上清，用1 mL完全培養(yǎng)液重懸沉淀細胞，細胞計數(shù)板進行計數(shù)，調(diào)細胞濃度為 5×105個/mL。

2）腫瘤抗原致敏DCs：將小鼠結(jié)腸癌細胞CT26反復凍融，制備成腫瘤抗原。加入到已加藥培養(yǎng)72 h的各分組的DCs中（上清液已取出），使DCs和腫瘤抗原的比例為1∶10。

3）ELISA法檢測APS干預的DCs對T細胞分泌細胞因子的影響：加抗原致敏的DCs于5% CO2，37℃培養(yǎng) 24 h后，每孔加入 5×105個/mL T 細胞100 μL，使DCs和脾臟淋巴細胞的比為1∶10。培養(yǎng)24 h后，收集各組上清液，按試劑盒操作說明操作檢測IL-2的含量。

4）脾臟淋巴細胞增殖檢測：小鼠DC與脾臟淋巴細胞共培養(yǎng)24 h后用全視野細胞成像分析儀檢測脾臟淋巴細胞增殖情況。

5）APS促DCs活化CTL發(fā)揮抗腫瘤作用的研究：將各組致敏DCs與T細胞按1∶10比例共同培養(yǎng)，2 d后收集懸浮細胞，進行細胞計數(shù)，調(diào)整T細胞濃度為1×106個/mL，制成CTL細胞懸液。取對數(shù)生長期腫瘤細胞，調(diào)整細胞濃度分別為1×105。取96孔板，加入CTL細胞和腫瘤細胞各100 μL，使其效靶比分別為10∶1。96孔板置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基，吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）雙熒光染色，通過全視野細胞成像分析，觀察死亡率。

2 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，首先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，若總體均滿足正態(tài)性和方差齊性，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 APS對DC2.4細胞成熟及活化的影響 為了研究APS對DC2.4成熟的影響，課題組檢測了APS對DC2.4表面標記物CD80和CD86表達的影響。由圖1A-B所示，與Control組比較，APS組和TNF-α組均可上調(diào)DCs表面標記分子CD80和CD86的表達，且兩者合用時效果最優(yōu)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。該實驗說明了APS和TNF-α合用可顯著促進DCs的成熟。

DC成熟后分泌的細胞因子IL-12p-70是誘導T細胞應答的必要條件，故本實驗檢測了APS對DC分泌細胞因IL-12p-70的影響。由圖1C所示，與Control組比較，APS和TNF-α均可促進DC分泌細胞因子IL-12p-70，且兩者合用時效果最優(yōu)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。該實驗進一步說明了APS和TNF-α合用可顯著促進DCs的成熟和活化。

圖1 APS對DC2.4細胞成熟及活化的影響

3.2 APS干預的DC2.4細胞對T細胞活化及殺傷腫瘤的影響 T細胞介導的免疫殺傷是機體對腫瘤的重要免疫應答，因此該實驗首先檢測了APS干預后的DC對T細胞活化的影響。如圖2A-B所示，與Control組相比，各加藥組對T細胞增殖及分泌IL-2的水平均顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且與APS組相比，APS+TNF-α組DCs對T細胞增殖及分泌IL-2水平的促進作用最強（P＜0.05）。該實驗說明APS干預后的DC2.4細胞促進了T細胞的活化，且與TNF-α合用時效果最優(yōu)。

本實驗將APS干預的DC刺激后的T細胞與CT26細胞共培養(yǎng)，檢測APS干預的DC對T細胞殺傷腫瘤的影響。如圖2C-D所示，與Control組相比，TNF-α組、APS組以及APS+TNF-α組腫瘤細胞的殺傷率均顯著增高，分別為 56.79、57.92和69.56%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中 APS+TNF-α組腫瘤細胞死亡率最高。該實驗表明APS干預后的DC2.4細胞增強了T細胞對腫瘤的殺傷。

圖2 APS干預的DC2.4對T細胞活化及殺傷腫瘤的影響

3.3 基于TLR4通路APS對DC2.4細胞成熟及活化的影響 為了進一步明確APS促DC2.4細胞成熟及活化的機制，本實驗使用TAK-242（TLR4抑制劑）和ST2825（MyD88抑制劑）阻斷TLR4介導的MyD88通路，觀察APS對DC2.4成熟及活化的影響。

如圖3所示，與TNF-α組相比，加入TLR4通路阻斷劑TAK-242或ST2825后，TNF-α組CD80/CD86的表達以及IL-12p-70的分泌均無顯著差異，說明阻斷劑TAK-242和ST2825對TNF-α作用效果無影響，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與TNF-α組相比，加入TLR4通路阻斷劑TAK-242或ST2825后，APS+TNF-α組 DC2.4細胞表面分子CD80/CD86的表達以及IL-12p-70的分泌水平也均無顯著差異（P＞0.05）。本實驗說明加入TLR4通路阻斷劑TAK-242或ST2825后，APS不能誘導DC2.4的成熟及活化，初步證明APS可能是通過TLR4介導的MyD88通路促DC2.4成熟及活化的。

圖3 基于TLR4通路APS對DC2.4成熟及活化的影響

3.4 基于TLR4通路APS干預的DC2.4細胞對T細胞活化及殺傷腫瘤的影響 阻斷TLR4介導的MyD88通路后，本實驗檢測了APS干預的DC2.4是否對T細胞的活化及殺傷腫瘤產(chǎn)生影響。如圖4所示，與TNF-α組相比，加入TLR4通路阻斷劑TAK-242和ST2825抑制劑后，各組T細胞增殖及分泌的IL-2水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），對腫瘤細胞CT26的殺傷水平也均無明顯差異（P＞0.05）。說明阻斷TLR4介導的MyD88通路后，APS干預的DC2.4細胞無法誘導T細胞產(chǎn)生應答并發(fā)揮殺傷腫瘤的作用。

4 討論

正常情況下，DCs在維持機體免疫平衡中起著重大的調(diào)節(jié)作用。但是在腫瘤微環(huán)境中存在著大量細胞因子抑制DCs功能，如PGE-2、IL-10和TGF-β等，從而導致腫瘤逃逸[16-17]。研究表明APS能增強人體免疫功能，提高免疫細胞的免疫活性，是理想的機體免疫增強劑[18]。如APS可增強巨噬細胞的吞噬作用[19]。CD80和CD86屬于免疫球蛋白超家族，其配體均是CD28和CD152，主要表達于活化的DCs表面，是DCs成熟的主要標志，也是DCs活化T細胞啟動機體免疫應答的重要信號[20-22]。TNF-α可促進DCs成熟，增強DCs對初始T細胞的刺激。因此本課題加入了TNF-α刺激DC，并考察APS與TNF-α合用對DC功能的影響。本研究發(fā)現(xiàn)DCs經(jīng)APS刺激后，CD80、CD86的表達均增高，提示APS誘導DCs的成熟，且與細胞因子TNF-α協(xié)同使用時效果最好。IL-12p-70是IL-12的活化狀態(tài)，具有促進Th0細胞向Th1細胞的分化，誘導T細胞活化，并增強IL-2、TNF-α的分泌等功能。本研究發(fā)現(xiàn)APS可促進DCs分泌IL-12p-70，說明APS可提高DCs的免疫活性，且與細胞因子TNF-α協(xié)同使用時效果最優(yōu)。

T細胞介導的免疫殺傷是機體抗腫瘤的重要免疫應答，IL-2是T細胞活化的標志。本實驗將APS活化的DCs與T細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細胞上清中IL-2分泌水平增高，且活化的CTL細胞對腫瘤細胞的殺傷作用增強，說明APS可促進DCs活化T細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。盡管這些研究結(jié)果揭示了APS具有提高DCs免疫功能，促進T細胞對腫瘤的殺傷，但其分子生物學機制有待闡明。

圖4 基于TLR4通路APS干預的DC2.4細胞對T細胞活化及殺傷腫瘤的影響

研究發(fā)現(xiàn)TLR4一旦識別了病原體中特定的分子結(jié)構(gòu)，就會激活細胞內(nèi)TLR下游一系列的信號通路，活化免疫細胞產(chǎn)生細胞因子。TLR4可通過MYD88通路，活化IKK2-TRAF6復合物，激活NF-κB，促進促炎因子的轉(zhuǎn)錄。為驗證APS是否通過TLR4信號通路影響DCs，本實驗加入TLR4關(guān)鍵節(jié)點抑制劑TAK-242和ST2825抑制劑，結(jié)果顯示經(jīng)TAK-242和ST2825阻斷通路后，與TNF-α組比較，抑制劑組對DCs表面分子CD80、CD86的表達、細胞因子IL-12 p-70的分泌以及對T細胞活化殺傷腫瘤作用均無顯著差異。本研究通過體外實驗初步闡明了APS通過TLR4信號通路促進DCs發(fā)揮抗腫瘤作用的機制。

綜上所述，本課題說明了基于TLR4通路，APS可促進DCs表面分子CD80、CD86的表達及細胞因子IL-12 p-70的分泌，進而活化T細胞，分泌IL-2，發(fā)揮抗腫瘤的作用，且與細胞因子TNF-α協(xié)同使用時效果最優(yōu)，為APS在臨床的應用提供理論基礎，為新藥的研制和開發(fā)提供新的視角。