陳莉 ，安海燕 ，郭曉媛 ，張承承

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腎病科，北京 100078）

糖尿病腎病（DKD）是糖尿?。―M）常見(jiàn)微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末腎臟病（ESRD）的主要原因。近些年來(lái)，DM的發(fā)病率逐年升高，國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)根據(jù)既往調(diào)查研究統(tǒng)計(jì)2019年全球DM患病率約9.3%，到2030年估計(jì)將上升至10.2%，而至2045年可能將上升至10.9%，由DKD及相關(guān)并發(fā)癥的治療將給全球醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]，因此，對(duì)于DKD的早期干預(yù)與治療也越加受到重視。既往對(duì)DKD早期腎臟病理的認(rèn)識(shí)均以腎小球損傷為主，但近些年來(lái)新的觀點(diǎn)認(rèn)為腎小管損傷可能才是DKD早期蛋白尿形成的主要原因[2]。腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin蛋白是重吸收尿蛋白的主要結(jié)構(gòu)，當(dāng)兩者表達(dá)減少時(shí)可導(dǎo)致蛋白尿加重。尿液中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）水平與白蛋白尿正相關(guān)，而與腎小球?yàn)V過(guò)率呈負(fù)相關(guān)，是腎小管損傷的標(biāo)記物，并且是監(jiān)測(cè)DKD很有前途的早期指標(biāo)[3]。腎小管損傷是導(dǎo)致DKD患者腎功能下降的主要原因。目前中醫(yī)在治療DKD上的優(yōu)勢(shì)越發(fā)凸顯，其中益腎化濕顆粒為近些年來(lái)新研發(fā)的中成藥，經(jīng)相關(guān)研究證實(shí)在改善DKD患者腎功能及并發(fā)癥上療效顯著[4-5]。本研究主要觀察益腎化濕顆粒減輕db/db小鼠早期腎小管損傷，延緩DKD進(jìn)展的作用，為臨床治療DKD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只SPF級(jí)健康雄性db/db小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量（35～45）g；6只 SPF 級(jí)健康雄性db/m 小鼠，6～7 周齡，體質(zhì)量（20～25）g，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2016-0010。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境，溫度21～22℃，相對(duì)濕度60%～70%，24 h晝夜循環(huán)光環(huán)境，動(dòng)物自由進(jìn)食，自由飲水。飼料為普通清潔級(jí)大鼠維持飼料，購(gòu)于北京科奧協(xié)力飼料有限公司。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查（201924）。

1.2 藥物 益腎化濕顆粒（廣州康臣藥業(yè)有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090250）；纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20040217）。

1.3 試劑及儀器 4%多聚甲醛（歐北生物科技有限公司）；兔抗megalin多克隆抗體（美國(guó)Proteintech Group公司）；羊抗cubilin多克隆抗體（美國(guó)R&D Systems公司）；NGAL酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；尿蛋白（UTP）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）檢測(cè)試劑（英科新創(chuàng)科技有限公司）；PAS染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。AU480型全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼公司）；切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特DH4000A）；MH-1微孔板震蕩器（kylin-Bell）；洗板機(jī)（Thermo）；普通光學(xué)顯微鏡（Olympus L340099）；成像系統(tǒng)（日本尼康Nikon DS-U3）。

1.4 分組及干預(yù) 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將18只自發(fā)型2型糖尿病db/db小鼠隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組、益腎化濕組，每組6只，另設(shè)雄性db/m小鼠6只為正常對(duì)照組。

纈沙坦膠囊及益腎化濕顆粒均以去離子水充分?jǐn)嚢杌靹颍?℃冰箱保存藥物，灌胃前將藥物從冰箱取出置于溫水中水浴至藥物溫度適中后再行灌胃，對(duì)照組及模型組予去離子水[10 mL/（kg·d）]灌胃。纈沙坦組予纈沙坦膠囊[（生藥13.33 mg/（kg·d）]灌胃，益腎化濕組予益腎化濕顆粒[（生藥5 g/（kg·d）]灌胃（約等于人體推薦劑量的 10 倍）[6]，連續(xù)干預(yù)12周。由于灌胃過(guò)程操作失誤，中藥組小鼠死亡1只。

藥物干預(yù)12周后代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，-20℃冰箱保存，備用24 h-UTP及NGAL檢測(cè)。采用1%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）將小鼠麻醉后取血，備用血液生化檢測(cè)。取血后處死小鼠，腎組織以4%多聚甲醛固定后備用PAS染色及免疫組化檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 血液標(biāo)本靜置2 h后，4℃、3 000 r/min、20 min離心提取血清，-80℃冰箱保存，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Scr、BUN、UA、TG、LDL水平。

1.5.2 24 h-UTP及尿NGAL水平檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24 h-UTP水平；ELISA法檢測(cè)尿液NGAL水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5.3 腎組織PAS染色 小鼠腎組織固定后脫水，石蠟切片置于60℃烤箱烘片30 min，分別用二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化，行PAS染色，400倍鏡下拍片。結(jié)果判定：采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行PAS染色分析，每張切片選6個(gè)視野，計(jì)算腎小球系膜和基底膜相對(duì)面積，取平均值。腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)=PAS陽(yáng)性染色面積/腎小球毛細(xì)血管袢總面積×100%[7]。

1.5.4 腎組織megalin、cubilin免疫組化染色 小鼠腎組織固定后脫水，石蠟切片脫蠟、水化，3%過(guò)氧化氫孵育10 min滅活過(guò)氧化氫酶，枸櫞酸緩沖液修復(fù)抗原，5%牛血清白蛋白封閉，分別加入一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)后脫水封片，200倍鏡下進(jìn)行拍片，結(jié)果判定：陽(yáng)性表達(dá)部分呈棕黃色顆粒狀，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)每張圖片選中區(qū)域進(jìn)行IOD（sum）及 Area（sum）采集，然后以 IOD（sum）/Area（sum）得到每張圖片的平均光密度值，每例切片測(cè)定5個(gè)非重復(fù)視野，結(jié)果取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析，方差齊時(shí)，各組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，則采用Tamhance’s T2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益腎化濕顆粒對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組小鼠血液UA、TG及LDL水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），BUN、Scr水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，纈沙坦組小鼠LDL水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），益腎化濕組小鼠UA、LDL水平下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），益腎化濕組小鼠血液TG水平有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠生化指標(biāo)比較（±s）

表1 各組小鼠生化指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組動(dòng)物數(shù)BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）UA（μmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）正常組 6 7.90±0.90 19.50±0.84 136.50± 24.53 0.28±0.06 0.18±0.03模型組 6 8.71±2.17 20.83±2.78 314.00±103.41** 0.86±0.44** 0.63±0.29**纈沙坦組 6 8.06±1.92 18.00±2.68 285.50± 92.21 0.83±0.33 0.29±0.11##益腎化濕組 5 7.97±3.16 19.40±3.13 177.80± 48.40# 0.66±0.23 0.34±0.20#

2.2 益腎化濕顆粒對(duì)小鼠24 h-UTP及尿液NGAL的影響 與正常組比較，模型組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，纈沙坦組及益腎化濕組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平有不同程度下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表 2。

表2 各組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平比較（±s）

表2 各組小鼠24 h-UTP及尿液NGAL水平比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組 動(dòng)物數(shù) 24 h-UTP（mg） NGAL（pg/mL）正常組 6 16.84± 9.51 4 944.08±1 485.27模型組 6 63.49±22.29** 8 053.05±1 103.24**纈沙坦組 6 30.82±12.29## 5 622.89±1 839.29#益腎化濕組 5 39.09± 9.82# 4 351.47±1 465.94##

2.3 益腎化濕顆粒對(duì)小鼠腎臟病理的影響 PAS染色提示，正常組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管清晰，基底膜均勻，未見(jiàn)明顯系膜基質(zhì)增生；模型組小鼠較正常組小鼠腎小囊腔狹窄，腎小球毛細(xì)血管腔不明顯，系膜區(qū)明顯增寬，系膜基質(zhì)增生，腎小管管腔不規(guī)則，部分腎小管刷狀緣丟失；纈沙坦組小鼠腎小球毛細(xì)血管清晰，基底膜稍增厚，局部系膜基質(zhì)增生，可見(jiàn)紫紅色糖原物質(zhì)沉積，部分腎小管管腔不規(guī)則；益腎化濕組小鼠系膜基質(zhì)增生不明顯，腎小球毛細(xì)血管腔明顯，腎小管排列規(guī)整，刷狀緣較完整，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腎組織PAS染色

Imagepro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)，與正常組比較，模型組小鼠腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組和益腎化濕組腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖 2。

圖2 各組小鼠腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)分析比較（±s）

2.4 益腎化濕顆粒對(duì)小鼠腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin蛋白表達(dá)的影響 正常組小鼠腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin蛋白均大量表達(dá)，主要表達(dá)在近端腎小管胞漿內(nèi)。與正常組比較，模型組小鼠腎組織 megalin、cubilin表達(dá)下降，Imagepro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)megalin、cubilin平均光密度值下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，纈沙坦組及益腎化濕組小鼠腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin表達(dá)增加，Imagepro Plus 6.0 統(tǒng)計(jì)平均光密度值有不同程度升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖 3、圖 4。

圖3 各組小鼠腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin蛋白的表達(dá)

圖4 各組小鼠腎小管megalin、cubilin表達(dá)的平均光密度值分析比較（±s）

3 討論

DKD主要以蛋白尿及腎功能下降導(dǎo)致的相關(guān)臨床癥狀為主，中醫(yī)多將之歸于“下消”“尿濁”“濁毒”“水腫”“關(guān)格”等范疇。對(duì)于DKD的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)，《靈樞·本臟》曰：“脾脆……善病消渴。”《外臺(tái)秘要·消渴消中》云：“消渴者，原其發(fā)動(dòng)，此則腎虛所致，每發(fā)即小便至甜?！薄额?lèi)證治裁·三消論治》曰：“小水不臭反甜者，此脾氣下脫?！笨梢?jiàn)本病發(fā)生發(fā)展與脾腎兩臟關(guān)系密切。腎主藏精，腎虛精失固攝，下泄形成蛋白尿。脾主運(yùn)化，通過(guò)脾升胃降使機(jī)體氣機(jī)升降有序，水液正常輸布至全身，若脾胃虛弱則易導(dǎo)致水液停滯，濕邪釀生，脾的生理特性喜燥惡濕，濕邪貫穿于DKD病程始終，濕邪可以反過(guò)來(lái)困遏脾陽(yáng)，導(dǎo)致脾氣不升，加重水液運(yùn)化功能障礙，濕性黏滯致病情纏綿難愈，反復(fù)發(fā)作，故治療DKD時(shí)應(yīng)當(dāng)重視健脾益腎，升陽(yáng)除濕。

益腎化濕顆粒原方出自李東垣《脾胃論》中的名方“升陽(yáng)益胃湯”，由人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、陳皮、炙甘草、柴胡、獨(dú)活、羌活、防風(fēng)、澤瀉、黃連、白芍等16味中藥組成，方中人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、陳皮、半夏取自六君子湯，為益氣健脾、燥濕化痰之代表方；黃芪為補(bǔ)氣之圣藥，五臟并補(bǔ)，還具有行水消腫的功效；柴胡、獨(dú)活、羌活、防風(fēng)為祛風(fēng)藥，味薄氣輕而升散之力強(qiáng)，黃連清熱燥濕，澤瀉祛下焦?jié)駶?，?dǎo)濕熱從小便排出，諸藥合用，有補(bǔ)有瀉，具有升陽(yáng)健脾，化濕清熱的功效。在此方中并無(wú)直接益腎的藥物，但卻以“益腎”為名，是基于脾腎兩臟之間的關(guān)系，通過(guò)補(bǔ)益脾胃，清化水濕之邪，使后天水谷精微之氣化生有源，從而得以不斷充盈先天，故能“益腎”。

目前，早期DKD損傷機(jī)制和治療靶點(diǎn)的研究已由以腎小球損傷為中心轉(zhuǎn)移到“糖尿病腎小管病（DT）”研究[8]。因此，腎小管損傷的防治研究具有重要的臨床意義。此外，國(guó)內(nèi)外對(duì)小鼠進(jìn)入早期DKD階段的判斷尚無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)，但基于對(duì)db/db小鼠腎臟病理特點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)該小鼠一般不會(huì)發(fā)展至腎小球硬化和腎功能進(jìn)行性下降的階段，因此廣泛用于研究早期DKD病變[9]。本實(shí)驗(yàn)中db/db小鼠24 h-UTP水平較正常組小鼠明顯升高，系膜基質(zhì)增生，腎小管刷狀緣丟失，伴有血UA及血脂水平的升高，而益腎化濕顆粒干預(yù)后可以有效降低24 h-UTP，緩解DKD系膜增生及小管病變，減輕db/db小鼠腎損傷，并且具有降低血UA和LDL水平的作用，提示益腎化濕顆?？梢酝ㄟ^(guò)改善DKD并發(fā)癥起到延緩疾病進(jìn)展的作用。

NGAL是一種分子質(zhì)量約25KD的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要由包括中性粒細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞在內(nèi)的各種上皮細(xì)胞釋放，其一般在正常人體內(nèi)保持著極低的水平，但是當(dāng)近端腎小管損傷時(shí)，其水平可顯著增加[10-11]，相關(guān)研究表明在DKD患者中，尿液NGAL水平與腎小管間質(zhì)損傷程度相關(guān)，可以作為腎小管損傷標(biāo)志物[12]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠尿液NGAL水平水平較正常組小鼠明顯升高，提示存在腎小管損傷，經(jīng)益腎化濕顆粒干預(yù)后db/db小鼠尿液NGAL水平明顯下降，說(shuō)明藥物可以有效保護(hù)腎小管。

Megalin和cubilin同屬低密度脂蛋白受體家族成員，在近端腎小管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)到這兩種蛋白受體的大量表達(dá)，并通過(guò)胞吞作用介導(dǎo)腎小管重吸收尿蛋白的過(guò)程，當(dāng)腎小管上megalin、cubilin缺失時(shí)可以導(dǎo)致顯著的蛋白尿生成[13]。DKD早期就可以出現(xiàn)megalin、cubilin的表達(dá)減少，并且隨病程進(jìn)展，這兩種蛋白的表達(dá)情況更進(jìn)一步下降。Peruchetti等[14]利用高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培育48 h后megalin表達(dá)明顯減少，Giraud-Billoud等[15]對(duì)糖尿病小鼠進(jìn)行觀察亦發(fā)現(xiàn)其腎皮質(zhì)上megalin、cubilin蛋白表達(dá)明顯減少，而尿白蛋白水平明顯升高，此外，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種改變很早就已經(jīng)發(fā)生[16-17]。因此，megalin、cubilin也可以反映 DKD 進(jìn)程中的腎小管損傷。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠較db/m小鼠腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin蛋白表達(dá)明顯減少并出現(xiàn)明顯蛋白尿，提示megalin、cubilin蛋白表達(dá)減少可能是db/db小鼠早期蛋白尿形成的主要原因。經(jīng)益腎化濕顆粒干預(yù)后，與模型組比較，db/db小鼠腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin蛋白表達(dá)明顯增加，說(shuō)明益腎化濕顆?？赡芡ㄟ^(guò)上調(diào)megalin、cubilin蛋白的表達(dá)從而減少尿蛋白的形成，可以在一定程度上緩解db/db小鼠早期腎小管損傷。

積極防治腎小管損傷對(duì)于延緩DKD病情具有重要意義，益腎化濕顆?？梢越档蚫b/db小鼠24 h-UTP，改善腎臟病理?yè)p傷，其作用可能與上調(diào)腎小管上皮細(xì)胞megalin、cubilin蛋白的表達(dá)，下調(diào)尿液NGAL水平，減輕早期腎小管損傷有關(guān)，但是對(duì)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。