鞏永永，端木慧子

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

TIFY蛋白是一類植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，以高度保守的TIFY結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫耐受中有重要的調(diào)控作用[1]。

TIFY結(jié)構(gòu)域由28個(gè)氨基酸和TIF[F/Y]XG核心區(qū)組成，最早在擬南芥中被注釋為ZIM（花序分生組織中表達(dá)的鋅指蛋白）結(jié)構(gòu)域，與TIFY家族蛋白的功能表達(dá)密切相關(guān)[2]。自Nishii等[3]首次對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)TIFY基因進(jìn)行鑒定后，水稻(Oryza sativa)[4]、葡 萄 (Vitis vinifera)[5]、大 豆 (Glycine max)[6]、小麥(Triticum aestivum)[7]等物種的TIFY基因家族鑒定也相繼完成，眾多研究表明TIFY家族蛋白可劃分為TIFY、JAZ、PPD和ZML四個(gè)亞家族[8]。其中，TIFY亞家族只含有TIFY結(jié)構(gòu)域，在擬南芥中可與其他調(diào)節(jié)因子相互作用來調(diào)控根的生長(zhǎng)發(fā)育[9]；JAZ亞家族由TIFY結(jié)構(gòu)域和Jas結(jié)構(gòu)域組成，后者具有高度保守的SLX2FX2KRX2RX5PY序列結(jié)構(gòu)[10]，核定位信號(hào)為PY-NLS[11]，可與MYC2轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)節(jié)植物的茉莉酸信號(hào)通路[12]；PPD亞家族由PPD結(jié)構(gòu)域、TIFY結(jié)構(gòu)域和羧基端不完整的Jas結(jié)構(gòu)域組成，前者為序列氨基端高度保守的55個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，后者在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為CCT結(jié)構(gòu)域，與JAZ亞家族中的Jas結(jié)構(gòu)域相比缺少重要的PY-NLS序列結(jié)構(gòu)，研究表明擬南芥中的PPD1能夠調(diào)節(jié)葉片生長(zhǎng)發(fā)育與形態(tài)構(gòu)成[13-14]；ZML亞家族由TIFY結(jié)構(gòu)域、CCT結(jié)構(gòu)域與GATA結(jié)構(gòu)域組成，該類蛋白主要參與植物光周期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與蛋白互作[15]。

由于測(cè)序技術(shù)的不斷完善，基因組數(shù)據(jù)測(cè)定已在大量物種中得以開展，這也為TIFY基因家族在全基因組水平的系統(tǒng)研究提供了便利。近年來，TIFY基因家族的鑒定分析在一些常見作物中陸續(xù)完成，揭示了TIFY家族的生物學(xué)功能，但許多重要經(jīng)濟(jì)作物的相關(guān)研究還依然存在不足。甜菜是中國(guó)重要糖料作物之一[16]，其耐寒性好且塊根蔗糖含量高，而且其制糖副產(chǎn)物糖蜜可產(chǎn)生甜菜堿、甲醇、乙醇、甘油、丙酮等化學(xué)物質(zhì)[17]，糖渣濾泥可充當(dāng)肥料，并具有中和土壤游離酸的作用[18]。除制糖之外，部分甜菜品種可供食用及飼用，具有廣闊的應(yīng)用前景，因此闡明TIFY基因家族對(duì)甜菜生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用具有重要意義。目前，研究甜菜TIFY基因的文獻(xiàn)較少，本研究采用生物信息學(xué)手段對(duì)BvTIFY基因進(jìn)行全基因組鑒定，同時(shí)分析其基因結(jié)構(gòu)、序列特征、染色體定位、啟動(dòng)子功能元件、進(jìn)化關(guān)系及鹽脅迫應(yīng)答模式，為進(jìn)一步剖析BvTIFY基因的生物學(xué)功能提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 BvTIFY基因家族的鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://ncbi.nlm.nih.gov/)和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)中下載甜菜蛋白組數(shù)據(jù)和TIFY結(jié)構(gòu)域(PF06200)隱馬爾科夫文件，利用HMMER軟件篩選甜菜基因組中可能的TIFY蛋白，并提交Pfam、SMART(https://smart.embl.de/)等在線程序驗(yàn)證保守結(jié)構(gòu)域組成，進(jìn)一步確定篩選結(jié)果，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取已鑒定完成的BvTIFY蛋白所對(duì)應(yīng)的CDS序列與基因組序列。

1.2 BvTIFY基因家族的分析

1.2.1 基因結(jié)構(gòu)分析 將甜菜TIFY基因家族的CDS序列與基因組序列提交至GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)在線程序，來進(jìn)行TIFY基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)的可視化。

1.2.2 序列特征分析 使用ClustalX軟件對(duì)甜菜和擬南芥的TIFY蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域序列特征來劃分甜菜TIFY蛋白的亞家族類型，并上傳至SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)來獲取不同結(jié)構(gòu)域的起止位點(diǎn)。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用MEGA5軟件對(duì)擬南芥AtTIFY、水稻OsTIFY及鑒定得到的甜菜BvTIFY蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，以對(duì)比結(jié)果構(gòu)建基于最大簡(jiǎn)約法(Maximum-parsimony)的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap數(shù)值設(shè)為1000，將構(gòu)建結(jié)果提交至Itol(https://itol.embl.de/)在線程序進(jìn)一步完善。

1.2.4 染色體定位及共線性分析 從NCBI、TAIR(https://www.arabidopsis.org/)、RAP-DB(https://rapdb.d-na.affrc.go.jp/)數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲取甜菜、擬南芥、水稻的基因組序列和GFF文件。從GFF文件中提取對(duì)應(yīng)物種的染色體長(zhǎng)度和基因組中TIFY基因的位置信息，利用MCScanX分析法對(duì)基因組序列與GFF文件進(jìn)行比對(duì)，以篩選同一或不同物種基因組間的共線性信息，從而預(yù)測(cè)TIFY基因家族在物種間的復(fù)制關(guān)系。所有數(shù)據(jù)通過TBtools[19]軟件進(jìn)行可視化。

1.2.5 啟動(dòng)子分析 對(duì)甜菜TIFY基因CDS上游2000 bp的片段進(jìn)行提取，上傳至PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/h-tml/)，來獲取啟動(dòng)子上的功能元件的類型和數(shù)量信息。

1.2.6 鹽脅迫應(yīng)答分析 實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)定了甜菜M14品系在對(duì)照以及中鹽、高鹽脅迫下的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，以此為基礎(chǔ)可分析甜菜TIFY基因在鹽脅迫下差異表達(dá)水平，使用TBtools軟件制作基因差異表達(dá)圖譜。

1.2.7 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè) 將鑒定所得的BvTIFY蛋白序列上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi-/input?sessionId=balp0yQK5OTf&input_page_active_fo rm=multiple_sequences)，來預(yù)測(cè)BvTIFY蛋白之間潛在的互作關(guān)系以及生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvTIFY基因家族成員

通過比對(duì)篩選，共從甜菜基因組中鑒定出21個(gè)TIFY基因，以BvTIFY來命名，按照不同基因在基因組上的位置進(jìn)行排序，并提交Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算BvTIFY蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)（表1）。其中BvTIFY1、BvTIFY2，BvTIFY3、BvTIFY4，BvTIFY5、BvTIFY6，BvTIFY8、BvTIFY9、BvTIFY10、BvTIFY11、BvTIFY12，BvTIFY16、BvTIFY17分別屬于同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本，在基因組上的位置相同，而BvTIFY21在已公布的甜菜參考基因組中尚無準(zhǔn)確定位。

表1 BvTIFY基因家族基本信息

2.2 BvTIFY基因家族的序列特征

BvTIFY基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)可視化結(jié)果如圖1所示。結(jié)合BvTIFY蛋白的進(jìn)化關(guān)系來看，除同一基因的轉(zhuǎn)錄本具有高度相似的基因結(jié)構(gòu)外，進(jìn)化距離較近的基因也擁有著較為一致的外顯子構(gòu)成，如BvTIFY15與BvTIFY18。進(jìn)化距離相對(duì)較遠(yuǎn)的基因其序列長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)都有著明顯差異，表明不同的BvTIFY基因之間有著較高的序列差異。

圖1 BvTIFY基因家族的結(jié)構(gòu)特征

使用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定BvTIFY蛋白的保守結(jié)構(gòu)域類型及位點(diǎn)，并結(jié)合Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各保守結(jié)構(gòu)域的注釋信息來區(qū)分BvTIFY蛋白所屬的亞家族。對(duì)于PPD亞家族而言，Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)并無PPD結(jié)構(gòu)域注冊(cè)信息，因此將擬南芥PPD亞家族成員AtTIFY4a、AtTIFY4b與甜菜BvTIFY蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，以確定甜菜TIFY蛋白中的PPD亞家族成員。經(jīng)過氨基酸序列特征對(duì)比，各亞家族成員及其結(jié)構(gòu)域特征如圖2所示。分析發(fā)現(xiàn)，BvTIFY1、BvTIFY2、BvTIFY13、BvTIFY15、 BvTIFY16、 BvTIFY17、 BvTIFY18、BvTIFY21屬于JAZ亞家族，具有典型的TIFY結(jié)構(gòu)域和Jas結(jié)構(gòu)域；BvTIFY8、BvTIFY9、BvTIFY10、BvTIFY11、BvTIFY12屬于PPD亞家族，序列特征為氨基端高度保守的PPD結(jié)構(gòu)域；BvTIFY3、BvTIFY4、BvTIFY5、BvTIFY6、BvTIFY14、BvTIFY20屬于ZML亞家族，除TIFY結(jié)構(gòu)域和CCT結(jié)構(gòu)域外，其羧基端具有保守的GATA結(jié)構(gòu)域。此外，BvTIFY7與BvTIFY19屬于TIFY亞家族，因其結(jié)構(gòu)域與其他亞家族TIFY結(jié)構(gòu)域相類似，故未作單獨(dú)比對(duì)。

圖2 BvTIFY蛋白亞家族成員及結(jié)構(gòu)域特征

2.3 TIFY家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

以甜菜BvTIFY序列、水稻OsTIFY序列、擬南芥AtTIFY序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。根據(jù)來自不同物種的TIFY蛋白結(jié)構(gòu)域類型可將其分為Ⅰ-Ⅴ組，其中Ⅰ、Ⅲ組對(duì)應(yīng)JAZ亞家族，Ⅱ組對(duì)應(yīng)PPD亞家族，Ⅳ組對(duì)應(yīng)TIFY亞家族，Ⅴ組對(duì)應(yīng)ZML亞家族，該分類結(jié)果與進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)較為一致。

圖3 TIFY家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 BvTIFY基因染色體定位及共線性分析

在篩除同一基因不同轉(zhuǎn)錄本與尚未確認(rèn)定位信息的BvTIFY21后，對(duì)剩余12條甜菜TIFY基因和20條水稻、18條擬南芥的TIFY基因進(jìn)行染色體定位分析，同時(shí)利用MCScanX對(duì)擬南芥、水稻和甜菜的基因組做共線性分析，以探究其TIFY基因之間的復(fù)制關(guān)系，結(jié)果見圖4。分析發(fā)現(xiàn)除了4號(hào)、5號(hào)染色體外，其他7條甜菜染色體上均有BvTIFY基因分布，其中1號(hào)染色體含有3條BvTIFY基因，2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)染色體上各含有1條BvTIFY基因，7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)染色體各有2條BvTIFY基因。就物種自身的TIFY基因家族共線性關(guān)系而言，BvTIFY基因間只有一對(duì)基因存在復(fù)制事件，為BvTIFY15與BvTIFY18，而水稻和擬南芥分別為3對(duì)和5對(duì)，與二者相比BvTIFY基因間的復(fù)制事件較少；對(duì)比3個(gè)物種的TIFY基因共線性可發(fā)現(xiàn)，甜菜與另兩個(gè)物種間TIFY基因的共線性要明顯高于自身TIFY基因的共線性，但擬南芥與水稻之間只有兩對(duì)TIFY基因存在共線性。

圖4 BvTIFY基因染色體定位及共線性分析

2.5 BvTIFY基因啟動(dòng)子分析

順式作用元件在決定各種壓力下的調(diào)節(jié)作用方面發(fā)揮著重要作用[20]。提取甜菜TIFY基因CDS上游2000 bp片段至PlantCARE進(jìn)行啟動(dòng)子上的功能元件分析，結(jié)果見圖5。在甜菜TIFY基因中共鑒定出8類作用元件，分別為茉莉酸甲酯(MeJA)、厭氧誘導(dǎo)(ARE)、干旱(MBS)、光(LRE)、脫落酸(ABRE)、水楊酸(SA)、低溫(LTR)及防御脅迫(TC-rich)響應(yīng)元件。除BvTIFY19外，其他基因都含有4類以上的功能元件。所有甜菜TIFY家族成員都含有光響應(yīng)元件，絕大多數(shù)含有厭氧誘導(dǎo)和脫落酸響應(yīng)元件，大部分成員含有干旱、低溫、水楊酸和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，還有少部分成員擁有防御脅迫元件，說明BvTIFY基因可能參與甜菜非生物脅迫應(yīng)答。

圖5 BvTIFY基因啟動(dòng)子功能元件分析

2.6 BvTIFY基因的鹽脅迫應(yīng)答分析

利用實(shí)驗(yàn)室前期中鹽(200 mmol/L)及高鹽(400 mmol/L)脅迫下甜菜根、葉的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析BvTIFY是否參與甜菜中鹽脅迫應(yīng)答。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中共篩選得到20個(gè)甜菜TIFY基因在鹽脅迫下的表達(dá)豐度。對(duì)200 mmol/L/0 mmol/L、400 mmol/L/0 mmol/L表達(dá)量比值做Log2處理來生成表達(dá)模式圖，當(dāng)Log2變化倍數(shù)大于1或小于-1時(shí)表明基因差異表達(dá)，結(jié)果見圖6。在甜菜葉片中，僅高鹽脅迫下BvTIFY13存在差異表達(dá)，其他成員表達(dá)水平變化皆不明顯；在根中，BvTIFY13和BvTIFY15在中鹽高鹽脅迫下均顯著上調(diào)表達(dá)，可能為甜菜耐鹽關(guān)鍵基因，BvTIFY5、BvTIFY6、BvTIFY20與BvTIFY7在中鹽及高鹽脅迫下也明顯存在表達(dá)水平變化，而BvTIFY1、BvTIFY2在高鹽脅迫下顯著下調(diào)表達(dá)。此外，根中BvTIFY19在中鹽和高鹽脅迫下分別上調(diào)和下調(diào)表達(dá)，反映出其對(duì)高鹽環(huán)境的不耐受，只能響應(yīng)中鹽脅迫。

圖6 BvTIFY基因鹽脅迫應(yīng)答分析

2.7 BvTIFY蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)21個(gè)BvTIFY蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖7所示。網(wǎng)絡(luò)中的BvTIFY蛋白除BvTIFY6以外都屬于JAZ亞家族；與其互作的蛋白中，XP_010690074.1為COI1蛋白，XP_010696336.1為bHLH13，屬于llld亞組bHLH轉(zhuǎn)錄因子，XP_010677236.1為MYC2轉(zhuǎn)錄因子，XP_010694121.1屬于細(xì)胞色素P450家族蛋白，XP_010688282.1屬于Ninja家族蛋白。根據(jù)以上結(jié)果可推測(cè)，BvTIFY2、BvTIFY18等JAZ亞家族蛋白通過彼此互作形成復(fù)合物來行使功能。

圖7 BvTIFY蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論和結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)研究方法，共鑒定出21個(gè)BvTIFY蛋白，包括2個(gè)TIFY亞家族蛋白、8個(gè)JAZ蛋白、6個(gè)ZML蛋白、5個(gè)PPD蛋白，對(duì)各亞家族成員進(jìn)行多序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果與前人研究相一致[9-14]?；驈?fù)制事件在植物功能多樣性和進(jìn)化機(jī)制中起著重要作用[21]，因此可通過分析不同基因組中基因排列順序的一致性（即共線性分析）來體現(xiàn)基因組中的復(fù)制事件[22]。對(duì)擬南芥、水稻、甜菜基因組的共線性分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)TIFY基因并非來源于基因復(fù)制，這表明在進(jìn)化上，TIFY基因的產(chǎn)生比擬南芥、水稻、甜菜的物種形成更為古老[23]。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，不同物種同一亞家族的TIFY蛋白的親緣關(guān)系較近，而同一物種不同亞家族的TIFY蛋白親緣性較差，這也表明TIFY蛋白的分化早于擬南芥、水稻、甜菜的進(jìn)化，在這些物種分化之前就已呈現(xiàn)出一定的多樣性。此外，水稻TIFY蛋白不含有PPD亞家族成員，鑒于水稻屬單子葉植物，可推測(cè)PPD亞家族成員是在單子葉植物向雙子葉植物進(jìn)化的過程中出現(xiàn)的[24]。

通過BvTIFY基因的鹽脅迫應(yīng)答分析可發(fā)現(xiàn)，BvTIFY15與BvTIFY18這對(duì)存在復(fù)制關(guān)系的基因其表達(dá)模式明顯不同，其原因可能為同源基因形成后表達(dá)特性發(fā)生了變化。同源基因分化后的功能分化是植物適應(yīng)外界環(huán)境的一種進(jìn)化機(jī)制[25]，這種基因表達(dá)多樣性規(guī)律有助于減少同源基因間的功能冗余。對(duì)其他非復(fù)制基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，它們具有類似的表達(dá)模式，說明這些基因的表達(dá)模式發(fā)生了趨同現(xiàn)象[26]。

BvTIFY蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，BvTIFY的JAZ亞家族成員與COI1蛋白、MYC2轉(zhuǎn)錄因子、Ninja蛋白、細(xì)胞色素P450蛋白和bHLH13蛋白構(gòu)成了一個(gè)調(diào)控植物體JA水平的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物JA信號(hào)通路的核心組件為COI1-JAZ-MYC2復(fù)合體[27]，正常情況下不執(zhí)行功能，其中的COI1-JAZ可作為共受體形式感知JA信號(hào)，并形成COI1-JAZ受體復(fù)合物來降解JAZ蛋白，從而釋放被禁錮的MYC2轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物體JA水平[28]。JAZ蛋白對(duì)MYC2轉(zhuǎn)錄因子活性的抑制是通過與Ninja阻遏蛋白的相互作用來實(shí)現(xiàn)的[29]，而bHLH13作為llld亞組bHLH轉(zhuǎn)錄因子，單獨(dú)存在時(shí)也能抑制JA信號(hào)[30]。此外，細(xì)胞色素P450家族蛋白能夠催化植物體多種物質(zhì)的代謝，對(duì)JA信號(hào)調(diào)節(jié)有著一定催化作用[31]。

本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)BvTIFY基因進(jìn)行全基因組鑒定，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、序列特征、染色體定位、啟動(dòng)子順式作用元件、系統(tǒng)進(jìn)化、鹽脅迫應(yīng)答模式和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。研究表明BvTIFY基因間存在較高的特異性，能夠在多種非生物脅迫和激素應(yīng)答中發(fā)揮生物學(xué)功能，其中BvTIFY13、BvTIFY15在甜菜鹽脅迫耐受中起到重要作用；此外，BvTIFY蛋白也具有與典型TIFY相似的結(jié)構(gòu)域特征，其JAZ亞家族成員能夠與互作蛋白相作用來調(diào)控植物體JA信號(hào)水平。以上結(jié)果可對(duì)后續(xù)BvTIFY基因在非生物脅迫下的功能驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)。