王琳玉，蔣依辰，于清洋，吳則東，邳 植

（1黑龍江大學現(xiàn)代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；2黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學，哈爾濱 150080）

0 引言

組蛋白乙?；揎椬鳛楸憩F(xiàn)遺傳調控的重要機制之一，參與了植物生長、發(fā)育和脅迫響應等過程[1]。組蛋白乙酰轉移酶(Histone acetyltransferase，HATs)和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDACs)可通過改變組蛋白電荷屬性促進或抑制基因表達[2]，從而催化可逆的組蛋白乙?；揎棥Ｔ谥参镅芯恐?，組蛋白乙?；揎椗c植物成花轉變密切相關。在擬南芥中，AtMSI1介導的H3K9ac能夠調控開花整合基因AtSOC1的表達，從而決定開花抽薹[3]。AtMSI1能夠與組蛋白去乙?；窤tHDAC6相互作用，參與H3K9的去乙酰修飾[4]。AtMSI4（又稱AtFVE1）參與CORs和CBFs等基因對低溫的應答[5]。同時，能夠識別AtFLC組蛋白H4，通過去乙?；揎椪{控AtFLC轉錄，參與調控春化途徑[6]。fve突變體內組蛋白乙酰化修飾水平顯著升高，具有明顯的晚花表型。相反，在擬南芥aldh3f1突變體組蛋白H3乙?；揎椝斤@著降低，低水平的H3K9Ac顯著抑制AtFLC基因表達，導致突變體表現(xiàn)出明顯的早花現(xiàn)象[7]。

真核生物HDAC家族包含RPD3/HDA1、SIR2、HD2三個亞家族[8]。RPD3/HDA1亞家族是一類Zn+依賴型HDAC，催化中心由2個Asp、2個His和1個Tyr組成。該亞家族成員數目最多且保守性較高。SIR2亞家族成員是一類NAD+依賴型HDAC，具有一個保守的SIR2domain，但在N-和C-末端序列差異較大[9]。在生物和細菌中一般含有1-2個SIR2基因，在真核生物中通常具有多個SIR2基因，例如人類中包含7個SIR基因、擬南芥中包含2個SIR基因。HD2亞家族是植物特有的一類HDAC，該家族成員在N-末端通常具有一個保守的MEFW序列和100個氨基酸左右的催化domain，該區(qū)域蛋白序列與the nucleoplasmin-like domain(NPL)具有較高的相似度。對擬南芥HDTs進行基因敲除發(fā)現(xiàn)，HD2亞家族成員廣泛參與成花轉變和種子發(fā)育等形態(tài)建成[10]。

甜菜(Beta vulgarisL.)莧科二年生草本植物，作為主要糖料作物提供全球20% ～30%的糖產量[11]。低溫引起的春化作用是決定甜菜生長期的重要因素，影響甜菜塊根的產量和含糖率[12]。前人研究已經成功從甜菜基因組中克隆了BvBTC1、BvFT1、BvFT2等多個春化相關基因，初步解析了一年生和二年生甜菜春化的分子機制[13]。目前，擬南芥和冬小麥等作物中的研究表明，組蛋白乙?；揎椀缺碛^遺傳調控是植物記憶冬季低溫和劑量春化時間的重要方式[14]。那么甜菜基因組中有哪些HDACs成員？其中哪些成員可能參與調控甜菜的春化作用？因此，研究BvHDACs基因家族成員在甜菜春化中的作用是非常有必要的。

本研究以HDAC特征domain和擬南芥HDAC蛋白序列為起始，通過HMMsearch和BLAST在甜菜基因組中對HDAC家族成員進行分析[15]。利用HMMER、iqtree、TBtools等 生 物 信 息 學 工 具 對BvHDACs基因家族成員基因結構、進化關系、染色體分布、春化過程表達模式進行分析，為解析BvHDACs基因家族成員在甜菜春化作用中的功能提供必要信息。

1 材料與方法

1.1 BvHDACs基因家族的鑒定

首先，分別從NCBI、Phytozome和甜菜數據庫(http://bvseq.molgen.mpg.de)下載人類、小鼠、果蠅、擬南芥、水稻、大豆、甜菜蛋白質組數據。以E-value＜1E-10和score＞50為閾值，利用HMMsearch程序在人類、小鼠、果蠅、擬南芥、水稻、大豆、甜菜蛋白質組中檢索含有Hist_deacetyl(PF00850)或SIR2(PF02146)功能結構域的蛋白質，分別鑒定為RPD3/HDA1和SIR2亞家族成員。由于目前沒有HD2亞家族的HMM模型，采用Blastp和HMMscan相結合的方式篩選HD2亞家族成員。以擬南芥AtHDT1-4蛋白序列檢索各物種中E-value＜1E-5且 score＞50的同源序列。隨后，通過HMMscan篩選N-末端僅含有NPL domain(PF17800)的蛋白質，鑒定可能是HD2亞家族成員。

1.2 HDAC基因家族系統(tǒng)進化樹的構建

利用Cluster Omega對篩選出的RPD3/HDA1、SIR2和HD2亞家族成員進行序列比對，所有參數采用默認值[16]。選擇乙酰氨基葡萄糖脫乙?；?AtLPXCA1)作為外類群，利用iqtree采用最大似然樹法構建進化樹。根據ModelFinder計算結果，選擇VT+I+G4為最優(yōu)模型，Bootstrap設置為1000。最后，使用EvolView工具對HDAC家族成員進化樹進行可視化[17]。

1.3 BvHDACs家族成員基因特征的分析

利用TBtools軟件從甜菜基因組gff文件中提取HDAC基因家族成員基因組定位、外顯子和內含子位置信息，并繪制的染色體定位圖譜。通過Expasy計算HDAC基因家族成員編碼蛋白分子量和等電點，蛋白功能結構域信息通過HMMscan進行檢索。

1.4 轉錄組分析BvHDACs家族成員表達模式

將KWS9147甜菜種子播種在方形花盆(12 cm×12 cm×10 cm)，在溫度24±2℃，光照強度200 μmol/(m2·s)和16 h/8 h光周期的溫室中進行培養(yǎng)。待播種后24天，將甜菜幼苗轉移到4±2℃，200 μmol/(m2·s)光強和16 h/8 h光周期的冷窖中進行春化處理。在春化0、2、6、10、14周后將不同程度春化幼苗移入溫室繼續(xù)進行培養(yǎng)，測定各處理甜菜幼苗抽薹率。同時，剪取甜菜幼葉，提取RNA建庫并進行轉錄組測序，分析春化過程中甜菜HDAC基因家族成員表達模式。

1.5 BvHDACs家族成員蛋白互作網絡分析

運用STRING(https://string-db.org/)數據庫在線分析BvHDACs家族蛋白互作關系，分別篩選出與蛋白界面兩個表面結構相似的蛋白對，通過SEARCH得到蛋白互作網絡，再從STRING中導出蛋白互作關系結果（參數為物理互作類型且score＞0.4）。最后，使用cytoscape繪制網絡圖[18]。

2 結果與分析

2.1 BvHDACs家族成員蛋白理化性質

16個BvHDACs家族成員的氨基酸長度、分子量大小和等電點都存在較大差異。表1可知，RPD3/HDA1亞家族成員通常氨基酸長度在350 aa ～500 aa，蛋白分子量在40 kDa ～70 kDa，蛋白質等電點在5.0 ～6.5之間。BvHDAC3與其他成員理化性質差異較大，該基因編碼蛋白氨基酸序列較短，僅124 aa，分子量13.5 kDa，等電點為8.49。3個HD2亞家族成員蛋白質長度均為290 aa左右，分子量在31k ～32 kDa，蛋白質等電點在4.6 ～4.7之間。SIR2亞家族成員中BvSIRT1-3具有相似的理化性質，氨基酸長度在43k ～56 kDa，分子量在43k ～55 kDa，等電點均大于7。BvSIRT4蛋白長度和分子量均小于其他SIR2成員，等電點為6.04。根據亞細胞定位預測，16個BvHDACs中有8個基因編碼蛋白具有明確的核定位信號。在人類HDACs中，II和IV類HDAC可能同時位于細胞質和細胞核中，與BvHDAC2、BvHDAC5、BvHDAC7、BvHDAC8被預測定位于細胞質中相符。此外，這些HDAC可能與其他蛋白形成復合體從而進入細胞核。

2.2 HDAC基因家族的系統(tǒng)進化樹分析

通過HMMsearch和Blastp方法在甜菜基因組內共檢索HDAC家族成員16個。圖1可知其中，9個基因屬于RPD3/HDA1亞家族，SIR2亞家族共有4個甜菜基因，HD2亞家族成員共有3個。為了進一步了解甜菜HDAC家族成員的分類及系統(tǒng)發(fā)育關系，分別從挑取不同動物（人類、小鼠）、昆蟲（果蠅）、植物（擬南芥、水稻、大豆）HDAC家族成員構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示，部分BvHDACs與HsHDACs具有較近的親緣關系(BvHDAC3、BvSIRT4)，但是大部分甜菜HDACs與植物HDACs構成單獨分枝，暗示HDACs在動植物中獨立進化參與不同的生物學過程。RPD3/HDA1亞家族成員最多，根據Milazzo等研究結果，該亞家族包括3個組（Class I ～III）。BvHDAC1、BvHDAC3、BvHDAC6、BvHDAC8-9與HsHDAC1-3、HsHDAC8共同歸屬于Class I。其中，BvHDAC3與HsHDAC3親緣關系較近，BvHDAC1和BvHDAC6則與其他植物HDACs組成單獨一支。Class II包含多個獨立分枝且動植物基因成員之間具有較大差異，BvHDAC4、BvHDAC5、BvHDAC7則分別位于植物特有的亞枝。Class III基因數目最少，僅有BvHDAC2歸屬于該組。SIR2亞家族中包括3個大枝，其中BvSIRT1和BvSIRT3與HsSIRT1、AtSRT1具有較高相似性。BvSIRT2、BvSIRT4則與HsSIRT4、HsSIRT5、AtSIRT2位于同一分枝。HD2為植物特有的HDAC亞家族，BvHDT1和BvHDT2與AtHDT1、AtHDT2和AtHDT4親緣關系較近。而BvHDT3與單子葉植物HDTs位于同一分枝。

2.3 BvHDACs染色體定位分析

利用TBtools軟件預測了候選的HDACs基因在染色體上的分布情況。在甜菜中，BvHDACs基因家族成員它們不均勻的分布在染色體上的見圖2。其中，BvHDAC9位于Chr-2，但并沒有明確掛載染色體中的具體位置。在Chr-4染色體上分布2個基因，分別為BvSIRT2和BvSIRT1定位到染色體的中上端的下末端。在Chr-5染色體上分布有3個基因，其中BvHDAC7和BvHDAC5并未定位到染色體的具體位置。BvHDAC6則定位到了染色體Chr-5的下端。在Chr-6染色體上端分布有1個基因(BvHDAC4)。在Chr-7染色體上分布有2個基因BvHDT3和BvHDAC8，分別定位染色體的上端與下端。在Chr-9染色體上分布有3個基因，其中BvHDT1和BvHDT2在染色體中距離較近，可能由于串聯(lián)重復事件產生。

圖2 BvHDACs基因染色體定位

2.4 BvHDACs家族成員基因結構分析

為了更加詳細的了解甜菜HDAC家族成員特征，對BvHDACs外顯子和內含子分布情況及蛋白質功能結構域進行分析見圖3。結構表明，甜菜HDAC家族成員通常含有7 ～16個外顯子。BvHDAC3、BvHDAC8和BvSIRT4含有較少的外顯子，分別為4個、3個和1個。其中，BvHDT1和BvHDT2不僅在染色體中的位置相鄰，同時外顯子和內含子分布相同，說明這2個基因為串聯(lián)重復基因。蛋白結構域方面，各HDAC亞家族內成員間domain分布具有較高的相似性。RPD3/HDA1和SIR2亞家族成員分別僅含有hist_deacetyl和SIR2功能結構域。HD2家族成員均在N末端含有一個NPL domain。

圖3 BvHDACs家族成員進化關系、基因結構和保守基序分析

2.5 BvHDACs家族成員在春化過程中的表達模式

春化處理后甜菜生長受到明顯抑制，但不會導致甜菜幼苗死亡。春化處理2周和6周后甜菜春化時間不充足，在后續(xù)長日照室溫條件下培養(yǎng)并不發(fā)生抽薹開花現(xiàn)象。約有67%的甜菜幼苗在春化10周后能夠抽薹開花。春化14周后，幾乎所有幼苗(96%)在后續(xù)長日照室溫培養(yǎng)中抽薹開花。通過檢測不同春化時間甜菜轉錄組數據發(fā)現(xiàn)（圖4），RPD3/HDA1亞家族成員在低溫處理后均出現(xiàn)上調變化。其中，BvHDAC1、BvHDAC2、BvHDAC5、BvHDAC6變化程度達到顯著水平。SIR2亞家族成員中僅有BvSIRT1在春化過程中顯著上調。值得注意的是，BvHDT1和BvHDT2在春化6 ～10周后顯著下調，基因表達量與春化后抽薹率的spearman相關系數分別為-0.824和-0.813。這暗示BvHDT1和BvHDT2可能與甜菜劑量春化時間相關。

圖4 BvHDACs基因家族在不同低溫脅迫下的基因表達

2.6 BvHDACs基因家族蛋白互作分析

通過檢索STRING數據庫，共發(fā)現(xiàn)10個蛋白主要與RPD3/HAD亞家族成員具有蛋白互作關系（圖5）。這些蛋白包括5個組蛋白結合蛋白（BvSYD、BvHMGB15、BvSIN3A、BvNCOR1和BvRB）、4個組蛋白修飾酶（BvJMJ11、BvJMJ12、BvHDAT3和BvFLD）和1個DNA甲基化酶（BvDMT）。其中，BvFLD、BvJMJ11和BvJMJ12在擬南芥中的同源基因參與春化和成花轉變過程[19-20]。BvJMJ11和BvJMJ12與BvHDAC1-9、BvSIN3A、BvNCOR1、BvRB具有構成蛋白復合體的潛力。BvFLD則與BvHDAC5和BvHDAC6具有蛋白互作關系。此外，HD2家族成員可能與BvHDAC6具有蛋白互作關系，而SIR2亞家族成員與哪些蛋白存在互作關系仍未可知。

圖5 BvHDACs家族蛋白互作網絡

3 討論與結論

組蛋白去乙?；?HDACs)是調節(jié)染色質結構和基因表達的關鍵表觀遺傳因子，在植物生長、發(fā)育和對冬性植物的春化機制反應中發(fā)揮重要作用[21]。截至目前為止，前人已對擬南芥[4]、玉米[22]和水稻[23]等植物HDAC基因家族進行了功能分析。本研究通過生物信息學手段從甜菜基因組中共鑒定16個BvHDACs成員，利用進化樹分析BvHDAC與其他物種HDACs的親緣關系，基于春化過程表達模式和互作蛋白關系分析哪些BvHDACs可能參與甜菜春化作用。

系統(tǒng)發(fā)育樹將16個BvHDACs分為3個亞家族，即RPD3/HDA1、SIR2、HD2。甜菜RPD3/HDA1家族Class I和IV、SIR2家族成員與人類HDACs具有一定的同源性。推測，丙戊酸、苯甲酰胺類等人類Class I和Class IV HDAC抑制劑可能在植物中同樣具有抑制作用[24]。此外，煙酰胺也同樣對植物SIRT家族成員產生酶活性抑制作用[25]。植物Class II成員與其他成員分別位于不同亞枝，暗示其植物與動物Class II成員蛋白特性和功能可能存在一定差異。同時，HD2家族是植物特有的HDAC，BvHDT1和BvHDT2與AtHDT4、AtHDT1和AtHDT2親緣關系較近，BvHDT3則與單子葉植物HDT具有較高的同源性。甜菜BvHDACs與人類、擬南芥HDACs的親緣關系將有助于判斷組蛋白抑制劑可能對哪些BvHDACs具有抑制作用，為今后挑選特定組蛋白抑制劑開展甜菜春化作用機制研究提供基礎信息。

AtHDACs能夠與AtMSI1和AtMSI4形成復合體，調控組蛋白乙?；揎棌亩绊慉tSOC1和AtFLC的轉錄，實現(xiàn)對擬南芥成花轉變的調控[26]。通過對擬南芥RPD3/HDA1亞家族成員進行沉默可以導致擬南芥晚花表型[27]。與擬南芥不同，筆者發(fā)現(xiàn)HD2家族成員BvHDT1和BvHDT2在春化過程中表達模式變化與抽薹率變化顯著相關，暗示其與參與甜菜春化時間劑量。此外，STRING分析表明BvHDT1和BvHDT2與BvHDAC6相互作用，可能與BvFLD、BvJMJ11和BvJMJ12形成蛋白復合體。在擬南芥中，AtJMJ11（又稱AtELF6）和AtJMJ12（又稱AtREF6）與植物抽薹開花密切相關，分別參與H3K4和H3K27甲基化修飾，調控開花整合基因AtFT和AtSOC1的表達[20]。AtFLD能夠調節(jié)H3K4的甲基化水平，參與AtFLC的表達[19]。這些結果表明BvHDT1和BvHDT2催化蛋白乙?；揎椏赡芘c甲基化修飾協(xié)同或拮抗決定甜菜抽薹開花。

綜上，本研究通過分析BvHDACs春化過程中的表達模式與蛋白互作關系發(fā)現(xiàn)甜菜HD2家族成員BvHDT1和BvHDT2可能與甜菜春化作用密切相關。根據染色體位置和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)BvHDT1和BvHDT2可能由單一基因串聯(lián)復制產生并與AtHDT1和AtHDT2直系同源。目前，暫未有HD2家族組蛋白抑制劑的相關報道。但是，有研究表明甜菜孢囊線蟲的32E03效應蛋白可以抑制AtHDT1的活性[28]。今后可通過外源注射或轉化32E03效應蛋白進一步驗證或分析BvHDT1和BvHDT2如何參與甜菜春化作用。