肖 陽，李慶榮，邢東旭，楊 瓊

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣州 510610）

0 引言

昆蟲為小型變溫動物，保持和調(diào)節(jié)體溫的能力有限，當(dāng)環(huán)境溫度超出一定范圍時，其生命活動將會受到嚴(yán)重影響，甚至可能引起死亡。高溫主要通過降低體內(nèi)含水量[1]、改變細(xì)胞內(nèi)離子濃度[2]、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3]、影響糖脂代謝[4]和生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能[5-6]等方面對昆蟲造成影響。在高溫環(huán)境的刺激下，部分昆蟲會啟動體內(nèi)對高溫的生理防衛(wèi)機(jī)制，比如夏滯育[7]、水分散失[8]、耐高溫相關(guān)基因的誘導(dǎo)表達(dá)[9]以及抗氧化酶活性的誘導(dǎo)增強(qiáng)[10]等。

華南蠶區(qū)地處熱帶亞熱帶氣候環(huán)境，極端高溫天氣頻發(fā)。高溫季節(jié)養(yǎng)蠶極易造成嚴(yán)重的損失，因此耐高溫家蠶品種在本蠶區(qū)的蠶業(yè)生產(chǎn)中有著極大的需求。多年以來，華南家蠶抗逆性品種選育技術(shù)以傳統(tǒng)雜交育種為主[11]，育種周期長，且難以突破抗逆性狀與產(chǎn)量質(zhì)量性狀之間“此消彼長”的矛盾，亟需在傳統(tǒng)育種技術(shù)的基礎(chǔ)上逐漸向周期短、針對性強(qiáng)的分子育種轉(zhuǎn)型。然而目前耐高溫相關(guān)基因的機(jī)理機(jī)制尚不清晰，嚴(yán)重影響了家蠶育種新技術(shù)的發(fā)展。

化學(xué)感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)是昆蟲體內(nèi)的一類小分子量結(jié)合蛋白，在不同物種之間CSPs的序列高度保守，其廣泛熟知的功能是作為信息素/氣味分子的轉(zhuǎn)運蛋白[12]，參與昆蟲嗅覺感受的初始過程[13]。CSPs最早在果蠅的觸須中被發(fā)現(xiàn)和鑒定[14-15]，由于觸須為昆蟲的主要信息感受器官，因此很長時間以來CSPs被認(rèn)為其功能僅與昆蟲的化學(xué)信息感受過程有關(guān)[16]，然而越來越多的證據(jù)表明CSPs在多個非化學(xué)感受器官也發(fā)生表達(dá)，在昆蟲體組織中分布廣泛[17-18]，且受微生物感染誘導(dǎo)發(fā)生顯著性表達(dá)變化[19]，在耐藥性種群中表達(dá)水平顯著高于敏感性種群[20]。Gong等[21]利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫分析鑒定了18個家蠶CSPs候選基因，發(fā)現(xiàn)其在觸角、頭、胸、腿、翅膀、睪丸、卵巢等多個家蠶組織中均存在不同程度的表達(dá)。鄧培淵等[22]對BmCSP8在不同發(fā)育時期的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其從家蠶1齡幼蟲期就開始表達(dá)，其表達(dá)持續(xù)了幼蟲的整個發(fā)育過程。由這些已報道的時空表達(dá)結(jié)果推測BmCSPs可能具有多樣化的生理功能，而不僅限于作為化學(xué)感受過程中的轉(zhuǎn)運蛋白。在前期研究中，本課題組通過高通量表達(dá)譜測序進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，篩選到與家蠶高溫耐受相關(guān)的BmCSPs[23-24]，并對其在家蠶物理屏障表皮中的表達(dá)進(jìn)行了分析[25]。

本實驗對高溫誘導(dǎo)條件下家蠶的消化吸收組織中腸、能量儲存組織脂肪體中的BmCSPs基因表達(dá)變化進(jìn)行分析，旨在探討B(tài)mCSPs基因在家蠶高溫耐受中的作用，為深入研究家蠶的高溫耐受機(jī)理以及家蠶抗性育種提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試家蠶品種與主要試劑

供試家蠶品種為本實驗室通過定向選育獲得的高溫耐受品系932G。主要試劑：Trizol Reagents（Invitrogen公司）、Evo M-MLV Plus 1st Strand cDNA Synthesis Kit(AG11615,Accurate Biotechnology,Hunan,Co.,Ltd)和SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11701,Accurate Biotechnology,Hunan,Co.,Ltd)。實驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所家蠶與微生物研究室于2020年5—9月開展。

1.2 方法

1.2.1 家蠶幼蟲高溫脅迫與取材 實驗設(shè)置高溫脅迫組（高溫組）和常溫對照組（對照組）。高溫組處理：將供試家蠶品種的幼蟲在常規(guī)條件下飼養(yǎng)至5齡第2天時，轉(zhuǎn)至溫度35±0.5℃、RH 85%±2%的人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行飼養(yǎng)。對照組處理：將供試家蠶品種的幼蟲在常規(guī)條件下飼養(yǎng)至5齡第2天時，轉(zhuǎn)至溫度27±0.5℃、RH 75%±2%的人工氣候培養(yǎng)箱中繼續(xù)飼養(yǎng)。分別于高溫脅迫1、6、18和36 h解剖家蠶取其中腸和脂肪體組織，以每3頭家蠶的中腸或脂肪體作為1個樣品。每次取樣均設(shè)3次重復(fù)，樣品收集后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 家蠶總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 通過Trizol法提取家蠶中腸和脂肪體樣品的總RNA，在BioTek SynergyTMLX多功能微孔板檢測儀上測定OD260/OD280的值和RNA樣品濃度，根據(jù)Evo M-MLV Plus 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒使用說明書將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取OD260/OD280比值在1.80～2.00之間的樣品，用于熒光定量PCR檢測。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 分別從家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(https://silkdb.bioinfotoolkits.net/main/species-info/-1)和GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)獲得了16個BmCSPs的CDS序列。以sw22934為內(nèi)參基因、BmCSPs為靶標(biāo)基因，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異引物（表1）。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR擴(kuò)增引物

1.2.4 熒光定量PCR檢測 熒光定量PCR方法參照SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit試劑盒操作說明進(jìn)行。反應(yīng)總體系20 μL，采用的兩步法PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火與延伸30 s，40個循環(huán)。通過Bio-Rad CFX Connect實時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因相對表達(dá)量分析，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，根據(jù)2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量[26]。

1.2.5 聚類與統(tǒng)計分析 利用MEGA軟件對BmCSPs基因序列進(jìn)行聚類分析，通過Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，采用SPSS Statistics 19的t檢驗方法對BmCSPs基因表達(dá)量在高溫組與對照組之間的差異顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmCSPs序列聚類分析

對GenBank中檢索到的16個家蠶化學(xué)感受蛋白家族成員基因進(jìn)行序列相似性分析。聚類分析結(jié)果（圖1）顯示，16個BmCSPs基因主要聚為2個大類，第1類包含成員較多，有BmCSP1、BmCSP2、BmCSP3、BmCSP4、BmCSP5、BmCSP6、BmCSP7、BmCSP9、BmCSP10、BmCSP12、BmCSP13及BmCSP14，第2類包括BmCSP8、BmCSP11、BmCSP15和BmCSP16。

圖1 BmCSPs基因CDS序列相似性聚類分析

2.2 高溫脅迫下BmCSPs在家蠶中腸組織中的表達(dá)

通過熒光定量PCR檢測方法，對16個BmCSPs在高溫脅迫后不同時間點(1、6、18、36 h)中腸組織中的表達(dá)變化情況進(jìn)行定量分析。在實驗設(shè)置的時間范圍內(nèi)，除BmCSP2以外的全部基因均能在中腸組織中檢測到表達(dá)。BmCSP1、BmCSP3、BmCSP4、BmCSP8和BmCSP10的相對表達(dá)量在高溫組與對照組之間無顯著差異，即在高溫脅迫前后其表達(dá)未發(fā)生顯著變化。BmCSP11、BmCSP15的相對表達(dá)量在高溫脅迫后所有時間點均比對照組上調(diào)，部分時間點上調(diào)顯著或極顯著，表明高溫脅迫對其表達(dá)可能具有一定的促進(jìn)作用。BmCSP6、BmCSP7、BmCSP9和BmCSP14的相對表達(dá)量在高溫脅迫后整體比對照組下調(diào)，部分時間點出現(xiàn)顯著下調(diào)，表明其表達(dá)可能受到高溫脅迫的抑制。BmCSP5和BmCSP13在高溫脅迫后相對表達(dá)量呈現(xiàn)隨時間延長而下降的趨勢；BmCSP12的表達(dá)量隨脅迫時間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在脅迫18 h時表達(dá)量出現(xiàn)峰值；BmCSP16受脅迫后的表達(dá)量變化則未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律（圖2）。

圖2 高溫脅迫不同時間5齡家蠶中腸中BmCSPs的表達(dá)變化

2.3 高溫脅迫下BmCSPs在家蠶脂肪體組織中的表達(dá)

對16個BmCSPs在高溫脅迫后不同時間點(1、6、18、36 h)脂肪體組織中的表達(dá)變化情況進(jìn)行定量分析。BmCSP2基因的表達(dá)情況與在中腸組織中類似，表達(dá)量過低，無法檢測到其表達(dá)值，其余15個基因在脂肪體中均能檢測到表達(dá)。BmCSP11的相對表達(dá)量在高溫組與對照組之間無顯著差異，即在高溫脅迫前后其表達(dá)未發(fā)生顯著變化。BmCSP13、BmCSP15的相對表達(dá)量在高溫脅迫后整體比對照組有所上調(diào)，部分時間點上調(diào)顯著，表明其表達(dá)可能受到高溫脅迫的刺激影響。BmCSP5在高溫組的所有時間點均比對照組下調(diào)；BmCSP7、BmCSP9和BmCSP14變化規(guī)律相似，在1 h時高溫組的相對表達(dá)量比對照組上調(diào)，而后絕大部分時間點均比對照組下調(diào)；BmCSP6在高溫組的相對表達(dá)量在6 h、18 h比對照組顯著下調(diào)，其在高溫組所有時間點的相對表達(dá)量都極低。BmCSP5、BmCSP6、BmCSP7、BmCSP9和BmCSP14的高溫組均在部分時間點比對照組出現(xiàn)顯著性下調(diào)，表明高溫脅迫可能對其表達(dá)具有一定的抑制作用。BmCSP8的表達(dá)量呈現(xiàn)隨高溫脅迫時間的延長而逐漸上升的趨勢，BmCSP1和BmCSP10的表達(dá)量隨脅迫時間延長而下降，BmCSP3、BmCSP4和BmCSP12的表達(dá)量隨脅迫時間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而BmCSP16隨脅迫時間延長呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢（圖3）。

圖3 高溫脅迫不同時間5齡家蠶脂肪體中BmCSPs的表達(dá)變化

3 討論

3.1 環(huán)境溫度對昆蟲的影響

溫度是所有的氣象因素中對昆蟲影響最顯著的，在合適的溫度范圍內(nèi)昆蟲的生長發(fā)育通常隨溫度的升高而加速[27]，而超出一定的溫度范圍則會使昆蟲的生理生化活動紊亂，極端低溫或高溫都可引起昆蟲的死亡。美國白蛾的越冬蛹受到-10℃低溫脅迫30 h后全部死亡[28]，梨小食心蟲在受到38℃高溫脅迫48 h后，其成蟲的死亡率高達(dá)90%以上[29]。昆蟲受到高溫脅迫后，機(jī)體發(fā)生一系列復(fù)雜的生理變化。36℃高溫處理后的家蠶5齡幼蟲血淋巴中蛻皮激素(20E)含量顯著升高，20E的多個響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄水平均發(fā)生上調(diào)，并使Akt磷酸化水平提高，激活下游的CncC/keap 1途徑，Cyp302a1等20E合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平也相應(yīng)上調(diào)[30]。

3.2 昆蟲對高溫的響應(yīng)機(jī)制

在長期的進(jìn)化過程中，不少昆蟲已經(jīng)形成應(yīng)對高溫環(huán)境的自我保護(hù)策略，如誘導(dǎo)產(chǎn)生熱激蛋白，使昆蟲體內(nèi)的其他蛋白免受高溫的破壞[31-32]；發(fā)生抗氧化反應(yīng)，清除高溫脅迫產(chǎn)生的過量活性氧(ROS)[33]等等。除此之外還存在眾多對高溫脅迫進(jìn)行響應(yīng)的其他基因，比如蓮草直胸跳甲[34]、美洲斑潛蠅[35]在受到高溫脅迫后，體內(nèi)多個P450基因發(fā)生了顯著性差異表達(dá)。鮑忠贊等[36]通過對5齡雌蠶SAGE文庫的構(gòu)建與分析，在高溫處理組與常溫組之間共獲得1062個差異表達(dá)基因，其中保幼激素甲基轉(zhuǎn)移酶、免疫相關(guān)的蛋白前體、RNA解旋酶等基因的表達(dá)差異最為顯著。本課題組Li[23]通過對高溫耐受性家蠶品種與敏感性品種在高溫脅迫前后的轉(zhuǎn)錄組分析，篩選到谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、鈣離子結(jié)合蛋白、保幼激素二醇激酶、化學(xué)感受蛋白等與家蠶高溫脅迫相關(guān)的基因，并進(jìn)一步對高溫脅迫前后的家蠶表皮組織中化學(xué)感受蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測。

3.3 BmCSPs響應(yīng)高溫脅迫的表達(dá)模式

本研究通過對家蠶中腸和脂肪體組織中BmCSPs響應(yīng)高溫脅迫的表達(dá)模式分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmCSPs在兩個組織中的表達(dá)變化有相似之處，但也存在差別。BmCSP15在兩個組織中受高溫脅迫的大部分時間點均出現(xiàn)上調(diào)，而BmCSP7、BmCSP9和BmCSP14則在兩個組織中均出現(xiàn)下調(diào)，推測BmCSP15與家蠶對高溫的耐受性密切相關(guān)，BmCSP7、BmCSP9和BmCSP14與高溫敏感性相關(guān)?；虮磉_(dá)量檢測結(jié)果與基因CDS序列的聚類結(jié)果大體上吻合，推測BmCSPs基因序列的差異性可能是引起其表達(dá)差異性的原因之一。李慶榮等[25]對家蠶表皮組織中8個BmCSPs基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果中，BmCSP8和BmCSP15的表達(dá)水平受高溫脅 迫 后 顯 著 上 調(diào)，BmCSP1、BmCSP4、BmCSP6、BmCSP7、BmCSP9和BmCSP11的表達(dá)則沒有發(fā)生顯著變化，這與本實驗結(jié)果有一定的差異，說明BmCSPs在中腸組織、脂肪體組織與表皮組織中的表達(dá)變化均不相同，其表達(dá)特點具有組織特異性。本實驗結(jié)果在前人的研究基礎(chǔ)上再次證實BmCSPs基因不僅在家蠶的感受器官中表達(dá)，也在其他組織部位廣泛表達(dá)，其功能可能涉及家蠶生長發(fā)育中的多個方面。BmCSPs基因究竟如何發(fā)揮其在高溫應(yīng)答中的功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過熒光定量PCR檢測，對16個BmCSPs在35℃高溫脅迫前后的家蠶中腸和脂肪體組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)BmCSPs成員在高溫脅迫下發(fā)生了轉(zhuǎn)錄水平的變化，其中BmCSP15在兩個組織中多數(shù)時間點均表達(dá)上調(diào)，而BmCSP7、BmCSP9和BmCSP14在兩個組織中均表達(dá)下調(diào)，推測BmCSP15與家蠶對高溫的耐受性密切相關(guān)，BmCSP7、BmCSP9和BmCSP14與對高溫的敏感性相關(guān)。BmCSPs基因按序列相似性可聚為2大類，基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果與基因序列聚類結(jié)果大致吻合。該結(jié)果可望為家蠶高溫耐受機(jī)理的闡明及耐高溫品種選育提供參考。