周磊 羅莉 盧志斌 丁衍 肖陽寶

氣管支氣管結核(tracheobronchial tuberculosis,TBTB)是國內良性氣管支氣管狹窄的首要病因，管腔疤痕組織形成也是TBTB介入治療后狹窄回縮的主要原因[1]。TBTB氣道內病灶處的成纖維細胞過度增殖、肉芽組織增生、炎癥反應增強、膠原纖維合成增多導致管腔反復瘢痕狹窄，甚至瘢痕閉塞，影響患者療效及預后[2-5]。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是細胞生長和增殖的重要調節(jié)因子[6]，在被激活的情況下，可促進細胞生長分裂及細胞外基質(如膠原蛋白)的分泌。自噬是細胞自我保護的一種機制，在氧化應激、DNA受損、各種理化因素的影響下自噬活性增強[7]，mTOR可通過抑制自噬的活性發(fā)揮調控作用[8]。有研究顯示，mTOR/自噬信號通路在結核分枝桿菌感染、纖維化病理生理過程中發(fā)揮作用，當結核分枝桿菌感染后，mTOR活性增強，自噬活性被抑制；當mTOR表達抑制，自噬活力恢復，可增強巨噬細胞的殺菌能力[9]。抑制mTOR/自噬信號通路可減少炎癥及生長因子如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子β(TGF-β)等表達[10-11]，減輕炎癥反應及瘢痕增生。本研究旨在探討mTOR/自噬信號通路在結核性氣管支氣管狹窄中的表達趨勢及致纖維化作用，以便深入了解結核性氣管支氣管狹窄的發(fā)病機制，為預防和治療該疾病提供新思路。

對象和方法

一、 研究對象

收集湖南省胸科醫(yī)院2020年6月至2021年6月經外科評估需要手術切除病灶的肺曲菌患者，共10例，作為正常對照組，包括男6例，女4例；年齡20～58歲，平均(39.7±11.1)歲。收集同期結核性氣管支氣管狹窄患者27例；男10例，女17例；年齡23～70歲，平均(45.5±12.0)歲；包括13例結核性增生患者(結核性增生組)，14例結核性瘢痕患者(結核性瘢痕組)。本研究通過湖南省胸科醫(yī)院倫理委員會批準 (編號：LS2021051805)。

二、納入和排除標準

1.結核性增生組及結核性瘢痕組的入選標準：根據《WS 288—2017 肺結核診斷標準》確診活動性肺結核患者；經支氣管鏡檢查和(或)病理學、細菌學檢查確診為氣管支氣管結核初治患者。結核性增生組在抗結核藥物治療1周后行支氣管鏡介入治療，活檢鉗取病變部位肉芽組織；結核性瘢痕組在抗結核藥物治療過程中患者有氣促癥狀，需要介入治療的瘢痕狹窄型氣管支氣管結核，在介入治療過程中活檢鉗取瘢痕組織[4]。

2.正常對照組排除標準：排除合并結核病及腫瘤、糖尿病、風濕免疫等其他疾病。

3.結核性增生組及結核性瘢痕組排除標準：排除合并耐藥結核分枝桿菌、人類免疫缺陷病毒感染及糖尿病的患者。

三、研究方法

1. 免疫組化：各組氣道肉芽、瘢痕組織等予以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后，通過免疫組化檢測mTOR、自噬相關蛋白3(LC-3)、TGF-β1、膠原蛋白1(COL-1)表達情況，使用光學顯微鏡拍片后，使用 ImagePro Plus 6.0圖像處理軟件對免疫組化圖片進行分析。

2. 蛋白質印跡法檢測mTOR、LC3蛋白表達水平：提取組織蛋白，經蛋白質定量BCA法蛋白定量后上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，分別切膠mTOR(250-289kD)，LC3(14-18kD)轉膜并封閉，將聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)分別與mTOR(1∶5000)、LC3(1∶1000)、β-肌動蛋白(β-actin)(1∶5000)一抗4 ℃孵育過夜，使用1%吐溫(TBST)緩沖液洗滌3次后，將膜放入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠或山羊抗兔的二抗中，室溫孵育1 h，使用增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯色曝光，并使用Image J 1.5圖像處理軟件分析目的蛋白和β-actin的平均灰度值，以相關目的蛋白與β-actin灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達量。

3. 運用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測TGF-β1、COL-1 mRNA相對表達量[1]：Trizol試劑提取組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳，以組織總mRNA為模板，逆轉錄cDNA，實時熒光定量PCR檢測TGF-β1、COL-1 mRNA的表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

4. 主要材料：PCR引物購自上海生工生物工程有限公司；總RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、實時定量逆轉錄PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗mTOR、兔抗LC3均購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗COL-1、兔抗TGF-β1均購自艾博抗(上海)貿易有限公司；HRP標記的山羊抗鼠、山羊抗兔的二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計量資料采用“均數±標準差”表示，對研究數據進行正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布時，多組比較采用完全隨機設計方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、各組mTOR、LC3、TGF-β1、COL-1免疫組化檢測蛋白表達情況

mTOR、TGF-β1、COL-1蛋白陽性表達量在結核性增生組中均高于結核性瘢痕組，在結核性瘢痕組中均高于正常對照組；LC3表達正好相反，正常對照組高于結核性瘢痕組，結核性瘢痕組高于結核性增生組。見表2。

表2 各組氣管支氣管組織免疫組化結果

二、各組mTOR、LC3蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平

mTOR蛋白表達量在結核性增生組高于結核性瘢痕組，結核性瘢痕組高于正常對照組；LC3蛋白表達量正好相反，正常對照組高于結核性瘢痕組，結核性瘢痕組高于結核性增生組。見圖1、表3。

圖1 各組mTOR、LC3在蛋白質印跡法中的蛋白相對表達量

表3 各組氣管支氣管組織中相關蛋白相對表達量

三、各組TGF-β1、COL-1 的RT-qPCR檢測mRNA的表達水平

TGF-β1、COL-1的mRNA表達量在結核性增生組中均高于結核性瘢痕組，結核性瘢痕組均高于正常對照組(P值均<0.05)。見表4。

表4 各組氣管支氣管組織中TGF-β1、COL-1 mRNA

討 論

結核性氣管支氣管狹窄是良性氣道狹窄發(fā)病最常見的病因[1-2，12]，除此之外，氣管插管、氣管切開等也可引發(fā)。不同于氣管插管、氣管切開等主要以機械損傷因素所致，結核性氣管支氣管狹窄發(fā)病是MTB對氣管支氣管壁持續(xù)破壞與機體組織修復導致的病理過程[13-15]，發(fā)病機制較為復雜，與炎癥及纖維化相關[4-5,16]， MTB侵蝕氣道黏膜、黏膜下層等，破壞氣道正常的組織結構，引起炎癥反應可以促進傷口分泌生長因子及炎癥介質引起病變部位肉芽增殖及瘢痕增生，導致結核性瘢痕氣道狹窄。

機體感染MTB后，MTB可通過促進機體巨噬細胞mTOR高表達，抑制自噬活性，進而減弱巨噬細胞滅菌能力[15-16]。而自噬增強可以促進巨噬細胞的滅菌作用。Kim等[17]研究顯示，異煙肼(INH)或者吡嗪酰胺(PZA)可激活被MTB感染巨噬細胞的自噬。如在肺纖維化、腎纖維化疾病發(fā)病過程中[18-19]，成纖維細胞mTOR高表達，自噬活性降低，進而促進成纖維細胞的增殖分化與細胞外基質的形成，導致疾病進展，而mTOR受體抑制劑雷帕霉素可以抑制成纖維細胞mTOR蛋白的高表達，恢復自噬的活性，減緩相關臟器的纖維化[20]。

本研究顯示，mTOR的表達在結核性增生組中表達最高，在結核性瘢痕組中次之，在正常對照組中表達最低，而自噬相關指標LC3的表達正好相反，在正常對照組中表達高于結核性瘢痕組，在結核性瘢痕組中表達高于結核性增生組，這與Rubinsztein等[21]和Singh和Subbian[9]研究結果類似。可見，不管是肺結核還是氣管支氣管結核的發(fā)病，可能都涉及mTOR/自噬信號通路的調控，在發(fā)病初期MTB毒力強，細菌負荷量大，mTOR高表達，自噬活性被抑制，導致機體抗MTB的能力減弱，因而感染發(fā)病。

當患者經過積極地抗結核治療或者通過自身的免疫功能，MTB毒力和數量已較前明顯下降，氣管支氣管結核的病變部位在愈合過程中可能出現肉芽增殖及瘢痕狹窄，因此，mTOR的表達在結核性增生組中高于結核性瘢痕組及正常對照組，結核性瘢痕組高于正常對照組，自噬相關指標LC3的表達正好相反。mTOR/自噬信號通路可刺激生長因子及膠原蛋白的分泌，促進病變部位纖維化，導致瘢痕增殖，各組TGF-β1、COL-1的表達與mTOR的表達趨勢一致，結核性增生組中表達高于結核性瘢痕組及正常對照組，結核性瘢痕組高于正常對照組，與自噬相關指標LC3的表達相反，表明mTOR/自噬信號通路作為上游信號通路在被激活的情況下，可促進下游TGF-β1、COL-1的表達，進而促進肉芽增殖及瘢痕形成，導致氣管支氣管管腔狹窄。

綜上所述，mTOR/自噬信號通路可能參與結核性氣管支氣管狹窄的發(fā)病，其發(fā)病可能與MTB感染所致mTOR的表達上調抑制自噬活性相關，在自噬活性被抑制的基礎上，調控生長因子TGF-β1的表達及膠原蛋白COL-1的分泌，促進瘢痕增生，最后導致氣管支氣管病變部位的瘢痕狹窄。

本研究是基于組織標本進行的研究分析，缺乏細胞機制及動物模型的深入研究，有待未來更進一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突