陳婷婷，吐爾遜阿依·買買提，陳思宇，李愛梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科,新疆 烏魯木齊 830011)

目前，包括冠狀動脈旁路移植術(shù) (Coronary artery bypass grafting,CABG)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù) (Percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA) 和溶栓術(shù)在內(nèi)的心臟治療包括冠狀動脈再通，可挽救缺血心肌并改善患者癥狀。但長期缺血后，患者在恢復(fù)血流灌注后可能會出現(xiàn)更明顯、更嚴(yán)重的心肌組織損傷和功能障礙，包括收縮功能下降、冠狀動脈血容量減少和血管反應(yīng)性低下，稱為心肌缺血再灌注損傷。心肌缺血再灌注(Ischemia reperfusion,IR)發(fā)生在心臟，但可損傷心臟周圍組織甚至遠(yuǎn)處器官，包括肺臟，這是對IR最脆弱的器官，并顯示出最早的臨床表現(xiàn)。因此，心肌IR誘導(dǎo)的急性肺損傷的分子機制已成為研究的熱點[1]。糖尿病患者比非糖尿病患者冠狀動脈疾病更嚴(yán)重，更容易發(fā)生急性心肌梗死。糖尿病患者出現(xiàn)多種呼吸功能異常，糖尿病心肌IR引起的急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)比非糖尿病患者更加嚴(yán)重[2]，然而其具體機制尚不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種作用，包括鈣儲存、蛋白質(zhì)合成和脂質(zhì)代謝[3]。急性肺損傷對細(xì)胞的損害或蛋白質(zhì)合成增加可導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊或未折疊蛋白的積累引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Encloplsmic reticulum，ERS)。三個跨膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器(PERK、IRE1α和 ATF6)與分子伴侶 GRP78 結(jié)合并保持非活動狀態(tài)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在高水平錯誤折疊蛋白時，GRP78 與其腔結(jié)構(gòu)域解離并誘導(dǎo)一系列轉(zhuǎn)錄和翻譯事件，啟動未折疊蛋白反應(yīng) (UPR)，從而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。然而，急性肺損傷引發(fā)持續(xù)高水平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，過度積累的錯誤折疊和未折疊蛋白以及鈣紊亂最終導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失、細(xì)胞炎癥和死亡[4]。

白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)天然存在于葡萄、桑樹和其他植物中，它是一種天然多酚，可以激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的Sirt1激動劑[5-6]。它具有抗氧化作用，影響下游信號通路。以往大量的體內(nèi)和體外研究表明，RSV可以通過激活Sirt1保護(hù)肺組織，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用[7-8]。然而，RSV在糖尿病心肌缺血再灌注所致ALI中的作用尚未見報道。本研究就Sirt1激動劑白藜蘆醇對糖尿病心肌IR所致ALI的保護(hù)作用及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系進(jìn)行初步探討?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:選用40只鼠齡6～8周的雄性SPF級Wistar大鼠,體重160～200 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境的溫度維持在18～22 ℃,濕度為60%～80%。

1.1.2 實驗藥物:白藜蘆醇(楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司,純度為99%)；肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥股份有限公司,批號151805062A)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與模型制備:糖尿病大鼠模型的建立采用如下方案。所有大鼠均采用高脂高糖飼養(yǎng)，為期4周，禁飲食12 h，按照每千克體重65 mg的標(biāo)準(zhǔn)予0.1 mmol/L鏈脲佐菌素腹腔注射，72 h 后測大鼠尾靜脈血血糖。糖尿病大鼠標(biāo)準(zhǔn)：血糖高于16.7 mmol/L，且持續(xù)1周，伴隨多飲、多食、多尿癥狀，40只大鼠中共32只成功建模。

采用隨機數(shù)字表法，將實驗大鼠分為四組：假手術(shù)組(DS組)、缺血再灌注組(DIR組)、白藜蘆醇低劑量組(RLIR組)、白藜蘆醇高劑量組(RHIR組)，每組8只。大鼠于實驗開始前12 h禁食，不禁飲。腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg,麻醉成功后取仰臥位固定，常規(guī)備皮，并予碘伏消毒3遍，連接心電圖機電極片，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)，所有大鼠行氣管插管并將其連接至小動物呼吸機，正壓通氣，通氣容量1.2 ml/100 g,頻率60次/min，I∶E=2∶1，從左側(cè)開胸，左側(cè)胸腔切開第四到五根肋骨，按500 IU/kg的標(biāo)準(zhǔn)從下腹部注射肝素鈉至腹腔，眼科剪剪開心包后可見冠脈前降支，位于左心耳與肺動脈圓錐間，冠脈下穿線備用。假手術(shù)組不做額外處理，雙線結(jié)扎其余組的冠脈前降支，若心電圖示T波高聳，ST段上抬，結(jié)扎處遠(yuǎn)端顏色變暗和收縮力減弱則說明心肌缺血，30 min后松開結(jié)扎線，恢復(fù)血流2 h。

1.2.2 給藥方法：RLIR組及RHIR組于模型制備前15 min及再灌注前1 min尾靜脈分別注射白藜蘆醇10 mg/kg及20 mg/kg。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 肺損傷的組織學(xué)檢查：各時間點實驗結(jié)束后采集每組大鼠的右側(cè)肺，取右肺上葉部分在4%多聚甲醛固定嵌入，并制成5 μm切片。這些切片用蘇木精和伊紅染色，光鏡下觀察肺組織損傷程度。

1.2.3.2 動脈血指標(biāo)檢測：實驗結(jié)束后取頸動脈血測量氧分壓，并分離血清，采用CBA法測量血清IL-4、IL-6、TNF-α水平。

1.2.3.3 肺濕干重比(W/D)：實驗結(jié)束后剝離左肺并取出，記錄濕重，干燥脫水后再次稱重，計算各肺葉濕干重比。

1.2.3.4 采用Western blot法檢測肺組織Sirt1水平及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白水平：取肺組織剪成小塊，研磨后勻漿離心，取上清液，以BCA 法測定蛋白濃度，另取50 μg 進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入GRP78(1∶500)、CHOP(1∶200)、Sirt1(1∶500)或β-actin抗體(1∶800)與一抗孵育過夜，以PDS洗膜3遍后加入HRP 標(biāo)記的二抗，再次以PDS洗膜，共3遍，進(jìn)行顯影，分析灰度值并計算各目標(biāo)蛋白與β-actin的比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，連續(xù)性變量數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析；計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，組間比較使用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗；P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織病理改變情況比較 DS 組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，上皮結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)未見明顯液體滲出和炎癥細(xì)胞浸潤;DIR組肺組織嚴(yán)重受損，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡內(nèi)有大量的液體滲出，有較多的炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)可見較多的紅細(xì)胞,呈現(xiàn)彌漫性肺間質(zhì)水腫。與DIR組相比，RHIR組肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，間質(zhì)輕度水腫，肺泡內(nèi)的液體、炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞明顯減少。RLIR組鏡下病理學(xué)改善不明顯(圖1)。

A:DS組；B:DIR組；C:RLIR組；D:RHIR組圖1 各組肺組織病理切片(HE染色，×200)

2.2 肺組織W/D比較 與DS組比較，DIR組大鼠肺W/D比值增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DIR組比較，RHIR組W/D比值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RLIR組與DIR組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 各組動脈血氧分壓比較 與DS組比較，DIR組大鼠動脈血氧分壓降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DIR組比較，RHIR組血氧分壓升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RLIR組與DIR組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組肺組織W/D、動脈血氧分壓比較

2.4 各組血清IL-4、IL-6、TNF-α水平比較 與DS組比較，DIR組大鼠血清IL-6、TNF-α升高，IL-4降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DIR組比較，RHIR組IL-6、TNF-α降低，IL-4升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RLIR組與DIR組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組IL-4、IL-6、TNF-α水平比較(pg/ml)

2.5 Western blot法檢測各組肺組織Sirt1、GRP78、CHOP的表達(dá)水平 與DS組比較，DIR組肺組織Sirt1蛋白水平降低，CHOP、GRP78蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與DIR組比較，RHIR組Sirt1蛋白水平升高，CHOP、GRP78蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RLIR組與DIR組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

3 討 論

心肌缺血再灌注可引起機體諸多損傷及應(yīng)激反應(yīng)，其中之一便是肺損傷，而糖尿病患者的肺CO2彌散能力降低，支氣管運動張力異常，對缺氧的通氣反應(yīng)減弱，呼吸肌肉強度降低，糖尿病可顯著加速呼吸功能的惡化[9]。因此糖尿病心肌缺血再灌注所致急性肺損傷更加嚴(yán)重[10]。本研究顯示，糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后導(dǎo)致了的肺組織損傷和肺水腫，動脈血氧分壓下降，循環(huán)中炎癥因子增加，Sirt1表達(dá)水平下降并伴有GRP78、CHOP表達(dá)的增加。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是真核細(xì)胞中常見的細(xì)胞器，是合成和修飾蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物的重要部位。在生理條件下,三種類型的跨膜蛋白PERK、IRE1、ATF6在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜側(cè)與細(xì)胞內(nèi)GRP78/Bip結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物。當(dāng)未折疊蛋白或錯折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集時，GRP78/Bip接收信號并與跨膜蛋白解離，同時與未折疊蛋白結(jié)合激活PERK、IRE1和ATF6這三條經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[11]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，加速非功能蛋白的降解，增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自我修復(fù)能力。Bip屬于熱休克蛋白70 (HSP70)家族，是ER的分子伴侶，又稱GRP78。它在ERS的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，其激活可以作為ERS反應(yīng)的標(biāo)記物。各種自身因素和外部環(huán)境，如細(xì)胞缺氧、細(xì)胞氧化應(yīng)激、營養(yǎng)不良、化學(xué)藥物刺激、鈣穩(wěn)態(tài)喪失等，可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常蛋白積累，從而誘發(fā)ERS。然而隨著ERS的持續(xù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)無法維持，可引起細(xì)胞凋亡。凋亡過程可通過誘導(dǎo)CHOP，活化Caspase-12，激活JNK信號通路而啟動。因此，GRP78和CHOP通常作為反映ERS水平的生物標(biāo)志物[12]。近年研究表明，ERS在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用，缺血再灌注可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)ERS。越來越多的研究表明ERS參與各種因素所導(dǎo)致的肺損傷，并且在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的病理生理作用[13-14]。研究證實ERS在2型糖尿病的病理生理機制中發(fā)揮了重要的作用，肥胖和2型糖尿病誘導(dǎo)的低度慢性炎癥和低氧微環(huán)境可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)異常折疊蛋白的積累[15]。本研究結(jié)果表明糖尿病心肌IR可引起肺組織ERS蛋白GRP78及CHOP的表達(dá)增加，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了心肌缺血再灌注所致肺損傷的發(fā)病機制。

Sirt1是一種 NAD+ 依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰酶，對多種細(xì)胞過程至關(guān)重要，包括代謝、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)和干細(xì)胞功能。Sirt1也是動物發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中尤為重要。如Sirt1對下丘腦功能有重大影響，細(xì)胞類型特異性 Sirt1突變導(dǎo)致全身能量代謝、晝夜節(jié)律和動物壽命的缺陷,SIRT1還調(diào)節(jié)樹突和軸突生長，并調(diào)節(jié)成人大腦中的突觸可塑性和記憶形成。此外，Sirt1已被證明可以改善阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓氏病[16]。Sirt1可能是調(diào)控ALI的潛在靶點，在不同類型的急性肺損傷中均發(fā)揮著重要作用[17]。研究表明RSV可通過激活Sirt1減輕肺水腫，下調(diào)致炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來保護(hù)肺組織[18-19]。此外，Sirt1在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面也發(fā)揮了重要的作用，它可通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)分子ORP150減輕或者緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]。研究證實Sirt1可通過PERK/eIF2α、ATF6/CHOP和 IRE1α/JNK介導(dǎo)的通路抑制內(nèi)質(zhì)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果表明Sirt1在糖尿病心肌IR后肺組織表達(dá)降低，而高劑量RSV可顯著激活Sirt1水平，明顯改善肺組織病理學(xué)損傷和肺水腫，提高動脈血氧分壓，并且伴有GRP78、CHOP的減少，說明Sirt1可通過調(diào)控ERS減輕肺損傷。

綜上所述，白藜蘆醇對糖尿病心肌IR所致肺損傷具有保護(hù)作用，其作用機制與激活Sirt1，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，但是否有其他途徑，尚需進(jìn)一步研究。