陳 瓊，金毓莉，杭遠(yuǎn)遠(yuǎn)，徐 梅，唐苾芯

(1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；3.上海市黃浦區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200010；4.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院，上海 200135)

卵巢儲(chǔ)備功能是指卵泡在卵巢皮質(zhì)中生長(zhǎng)并形成可受精卵泡的能力，包括女性剩余卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量[1]。育齡期女性隨著年齡的增長(zhǎng)，卵巢中募集的卵泡逐漸減少，卵子的質(zhì)量也在下降，這一過(guò)程稱(chēng)為卵巢儲(chǔ)備功能降低(Decreased ovarian reserve，DOR)，預(yù)示著生育能力下降，在1～6年內(nèi)有發(fā)展成為卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的風(fēng)險(xiǎn)[2]。2004—2011年，美國(guó)DOR患病率從19%升高至26%[3]。DOR的主要癥狀包括40歲以前女性出現(xiàn)月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)和不孕，并伴有圍絕經(jīng)期癥狀，如潮熱、盜汗，與反復(fù)流產(chǎn)、不明原因的不孕、輔助生殖反復(fù)種植失敗、先兆流產(chǎn)等生育問(wèn)題密切相關(guān)。因此，有效治療DOR對(duì)不孕夫婦和提高女性生活質(zhì)量具有重要意義。

中醫(yī)藥基于“治未病”的思想上治療DOR具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。蔡氏婦科育腎助孕方的臨床療效顯著，前期研究證實(shí)，育腎助孕方可上調(diào)卵巢抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達(dá)，從而抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[4]，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)、分泌，起到改善卵巢儲(chǔ)備功能的作用[5]。細(xì)胞凋亡指為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡的一種程序性死亡。MAPK信號(hào)通路(包含ERK通路和JNK通路)與細(xì)胞分化、增殖和凋亡密切相關(guān)。有研究證實(shí)ERK和JNK信號(hào)通路在卵巢細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，是Bcl-2、Bax、Caspase-3的上游激酶[6]。故本研究結(jié)合前期研究結(jié)果，以DOR大鼠模型為研究對(duì)象，觀察育腎助孕方對(duì)卵巢組織中ERK1/2及JNK1/2蛋白活化的影響，探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康清潔級(jí)雌性SD大鼠，12周齡，48只，體重250～280 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK(滬)2009-0086，檢疫合格備用。大鼠飼養(yǎng)在上海市第一人民醫(yī)院清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)保持恒定溫度、濕度，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備 雷公藤多苷片：10 mg/片，江蘇美通制藥有限公司(批號(hào)：131029)，以純凈水溶化，配制濃度為5 mg/ml。戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè))：1 mg/片，用純凈水溶化，配制濃度為0.05 mg/ml。育腎助孕方免煎顆粒劑(由廣州一方中藥廠提供)：白茯苓12 g，熟地、山萸肉、淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉、鹿角霜、醋龜板各10 g，上述藥物等量免煎顆粒劑劑量為：熟地2.5 g，白茯苓0.6 g，山萸肉、巴戟天各3 g，淫羊藿、鹿角霜各0.5 g，肉蓯蓉2.5 g，醋龜板0.7 g，純凈水配制成低、中、高3個(gè)濃度混懸液，4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?，灌胃前搖勻。

1.3 主要試劑與儀器 p-ERK抗體，美國(guó)CST公司(批號(hào)：4370S)；ERK抗體，美國(guó)CST公司(批號(hào)：4376S)；p-JNK抗體，美國(guó)CST公司(批號(hào)：4668)；JNK抗體，美國(guó)CST公司(批號(hào)：9252)；GAPDH抗體，美國(guó)CST公司(批號(hào)：5174)；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：A0208)；羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：A0216)；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液，上?；鶢栴D生物有限公司(批號(hào)：BYL40825)；BCA蛋白定量試劑盒，美國(guó)Thermo Scientific公司(批號(hào)：PICPI23223)；NC膜，美國(guó)millipore公司(批號(hào)：HATF00010)；蛋白預(yù)染Marker，加拿大Fermentas公司(批號(hào)：SM1811)；發(fā)光液，美國(guó)Millipore公司(批號(hào)：WBKLS0100)；mini protean 3 cell電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；PS-9型電轉(zhuǎn)儀(大連競(jìng)邁科技有限公司)；MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)；CX41型正置顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.4 分組及給藥 將48只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為六組：對(duì)照組，模型組，補(bǔ)佳樂(lè)組，育腎助孕方低、中、高劑量組，每組8只。每組連續(xù)2周上午及下午各灌胃1次。對(duì)照組：每日2次灌胃3 ml 0.9%氯化鈉水溶液；模型組：雷公藤多苷造模劑量按照50.00 mg/kg體積灌胃，雷公藤多苷溶液及0.9%氯化鈉水溶液各1次；補(bǔ)佳樂(lè)組：補(bǔ)佳樂(lè)按照0.21 mg/kg體積灌胃，雷公藤多苷溶液及補(bǔ)佳樂(lè)溶液各1次；育腎助孕方低、中、高劑量組按照臨床等效劑量的0.5倍(0.69 g/kg)、1倍(1.38 g/kg)和2倍(2.76 g/kg)給藥，每次灌胃前搖勻，每組雷公藤多苷溶液及各濃度育腎助孕方中藥溶液各1次。以上給藥劑量均根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”計(jì)算出藥液體積稀釋為3 ml。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 取材：大鼠處死后在無(wú)菌條件下取出卵巢，稱(chēng)重，部分卵巢福爾馬林固定，部分卵巢置于-80 ℃冰箱待用。

1.5.2 卵巢組織形態(tài)觀察：卵巢置于福爾馬林中固定48 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋切片，片厚4 μm，常規(guī)HE染色，置于顯微鏡下觀察卵泡、黃體及顆粒細(xì)胞等變化。

1.5.3 Western blot法檢測(cè)卵巢組織ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2及p-JNK1/2蛋白表達(dá)：將卵巢組織剪成細(xì)小的碎片，按每20 mg組織加入150～250 μl裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解，離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量。按實(shí)驗(yàn)常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后加入一抗(ERK1/2 1∶1000稀釋?zhuān)琾-ERK1/2 1∶1000稀釋?zhuān)琾-JNK1/2 1∶800稀釋?zhuān)琂NK1/2 1∶1000稀釋?zhuān)珿APDH 1∶1500稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育；之后加入二抗，與膜37 ℃孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。膠片掃描后獲得圖像，計(jì)算目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)圖采用Graph Pad Prism軟件繪制。組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢組織病理觀察結(jié)果 對(duì)照組卵巢結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)生長(zhǎng)卵泡數(shù)量、形態(tài)正常，顆粒細(xì)胞多層排列整齊，卵泡液含量多，可見(jiàn)發(fā)育好、體積大的黃體；模型組見(jiàn)部分卵巢萎縮，生長(zhǎng)卵泡數(shù)量減少、閉鎖卵泡數(shù)量增多，顆粒細(xì)胞排卵紊亂且層數(shù)減少，黃體數(shù)減少、體積減小；補(bǔ)佳樂(lè)組卵巢組織形態(tài)與對(duì)照組相近，可見(jiàn)生長(zhǎng)卵泡，但閉鎖卵泡較對(duì)照組多；育腎助孕方低劑量組較模型組卵巢組織形態(tài)有所改善，卵泡數(shù)量比對(duì)照組少，黃體數(shù)目也比對(duì)照組少；育腎助孕方中、高劑量組卵巢形態(tài)與對(duì)照組相似，卵泡結(jié)構(gòu)清晰，顆粒細(xì)胞多層次，卵泡數(shù)目及黃體數(shù)目較模型組增多(圖1)。

圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)比較(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白總相對(duì)表達(dá)量及磷酸化水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、補(bǔ)佳樂(lè)組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白總相對(duì)表達(dá)量比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對(duì)照組比較，模型組和育腎助孕方低、中劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯增加(P<0.05)，補(bǔ)佳樂(lè)組和育腎助孕方高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白磷酸化水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1(圖2、3)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，△P<0.05圖2 各組大鼠卵巢組織ERK1/2蛋白總相對(duì)表達(dá)量及磷酸化水平比較

2.3 各組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白總相對(duì)表達(dá)量及磷酸化水平比較 與對(duì)照組比較，模型組、補(bǔ)佳樂(lè)組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK蛋白總相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，模型組和育腎助孕方低劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平明顯增加(P<0.05)，補(bǔ)佳樂(lè)組和育腎助孕方中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，補(bǔ)佳樂(lè)組和育腎助孕方低、中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，育腎助孕方中、高劑量組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，低劑量育腎助孕方組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白磷酸化水平明顯高于補(bǔ)佳樂(lè)組(P<0.05)。見(jiàn)表1(圖3、4)。

表1 各組大鼠卵巢組織ERK1/2和JNK1/2蛋白總相對(duì)表達(dá)量及磷酸化水平比較

A:對(duì)照組；B：模型組；C:補(bǔ)佳樂(lè)組；D:育腎助孕方低劑量組；E:育腎助孕方中劑量組；F:育腎助孕方高劑量組圖3 各組大鼠卵巢組織p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2、JNK1/2蛋白表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)佳樂(lè)組比較，△P<0.05圖4 各組大鼠卵巢組織JNK1/2蛋白總相對(duì)表達(dá)量及磷酸化水平比較

3 討 論

DOR是常見(jiàn)的女性生殖內(nèi)分泌疾病。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)DOR發(fā)病常與年齡增長(zhǎng)、遺傳因素、自身免疫因素、盆腔因素、環(huán)境污染、不良生活方式、精神壓力等有關(guān)[7]。

中醫(yī)學(xué)中無(wú)DOR，根據(jù)其臨床癥狀可歸于“閉經(jīng)”“月經(jīng)后期”“斷經(jīng)前后諸證”“不孕”等疾病中。生育能力是指在1個(gè)月經(jīng)周期內(nèi)受孕的概率，其在30歲初即開(kāi)始顯著下降，幾年后(約37歲)下降得更快[8]。隨著國(guó)家二胎政策進(jìn)一步開(kāi)放和初產(chǎn)婦平均年齡逐漸升高，年齡越大，生育力越低，越來(lái)越多的高齡女性不得不面對(duì)不孕癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，35歲以下的不孕患者中DOR發(fā)病率約6.3%[9]。DOR是POF的早期階段，臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，需要結(jié)合檢查如：抗苗勒管激素(AMH)下降、促卵泡刺激素(FSH)升高、雌二醇(E2)下降、FSH/LH升高、超聲下見(jiàn)卵巢體積縮小等。因此，若40歲之前的女性出現(xiàn)了經(jīng)量減少、月經(jīng)稀發(fā)、崩漏甚至閉經(jīng)、圍絕經(jīng)期表現(xiàn)時(shí)，應(yīng)及時(shí)明確診斷，做到未病先防，已病防變，早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)DOR。

雷公藤屬于細(xì)胞毒性藥物，具有生殖毒性。本研究中，模型組見(jiàn)部分卵巢萎縮，生長(zhǎng)卵泡數(shù)目減少，顆粒細(xì)胞減少和黃體減少，各級(jí)卵泡數(shù)目減少，提示雷公藤多苷灌胃可致大鼠的卵巢功能降低，進(jìn)而卵巢萎縮，該結(jié)果與杜清等[10]的結(jié)果一致。說(shuō)明雷公藤多苷能夠明顯降低大鼠的卵巢儲(chǔ)備功能、減少卵泡數(shù)量。有研究發(fā)現(xiàn)，氟化鈉可通過(guò)促進(jìn)p-ERK及p-JNK活化，降低Bcl-2表達(dá)，增加Bax表達(dá)，觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)卵巢細(xì)胞凋亡[6]。雷公藤多甙片[11]可能通過(guò)ERK、JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)卵巢組織中線粒體和死亡受體凋亡途徑發(fā)生過(guò)度激活，造成細(xì)胞凋亡，抑制卵泡生長(zhǎng)，引發(fā)卵巢功能損傷。雷公藤甲素可通過(guò)引起ERK/c-fos異常表達(dá)導(dǎo)致卵巢細(xì)胞凋亡[12]。JNK促進(jìn)促凋亡蛋白Bax在激活時(shí)移位到線粒體，從而激活細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠的p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，結(jié)合前期研究結(jié)果[4]提示雷公藤多苷可能通過(guò)促進(jìn)p-ERK1/2及p-JNK1/2活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)DOR的發(fā)生。

蔡小蓀教授治療不孕基于《傅青主女科》云：“經(jīng)水出諸腎”“經(jīng)水早斷，似乎腎水衰涸”以補(bǔ)腎為基本法則創(chuàng)制育腎助孕方，臨床亦以補(bǔ)益肝腎，培元育孕為治療DOR的主要思路，育腎助孕方從六味地黃丸化裁，僅用其半，熟地、茯苓、山萸肉補(bǔ)脾腎和中，養(yǎng)血滋陰；淫羊藿、巴戟天、肉蓯蓉溫腎興陽(yáng)；鹿角霜補(bǔ)腎強(qiáng)督，調(diào)理沖任，性較溫和；醋龜板滋陰潛陽(yáng)，補(bǔ)腎益精，制約諸溫陽(yáng)藥之溫燥，以使陰陽(yáng)平衡而相得益彰。《醫(yī)學(xué)正傳》曰：“月經(jīng)全借腎水施化，腎水既乏，則經(jīng)血日以干涸”，故臨床醫(yī)家多認(rèn)為DOR的主要病機(jī)在腎虛，補(bǔ)腎填精為治療大法[14-16]。育腎助孕方中用以大量補(bǔ)腎藥，在補(bǔ)腎的同時(shí)注意顧護(hù)脾氣，后天源源不斷生化精微，涵育先天，重振根基，從而為孕育夯實(shí)基礎(chǔ)。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明：補(bǔ)腎中藥能抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[17]；干預(yù)氧化應(yīng)激過(guò)程，延緩端粒衰老速度，保護(hù)卵母細(xì)胞，延緩卵巢組織衰老[18]；補(bǔ)腎中藥能作用于性激素、內(nèi)分泌、免疫、細(xì)胞增殖等多個(gè)通路，其中補(bǔ)腎陽(yáng)中藥在卵細(xì)胞成熟相關(guān)通路存在作用靶點(diǎn)[19-20]，達(dá)到從多途徑、多階段、多靶點(diǎn)改善DOR患者的臨床癥狀、內(nèi)分泌指標(biāo)以及妊娠結(jié)局的治療目的。該研究結(jié)果顯示，補(bǔ)佳樂(lè)和育腎助孕方各組卵巢組織形態(tài)、卵泡生長(zhǎng)和顆粒細(xì)胞排列等較模型組改善，提示藥物治療后可能對(duì)卵巢功能有所改善，中藥濃度升高可能與改善程度正相關(guān)。補(bǔ)佳樂(lè)組、育腎助孕方高劑量組p-ERK1/2及p-JNK1/2表達(dá)均與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。育腎助孕方各組p-ERK1/2及育腎助孕方中、高劑量組p-JNK1/2蛋白表達(dá)與補(bǔ)佳樂(lè)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且均明顯低于模型組。提示育腎助孕方可能通過(guò)降低p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白活化，減少卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，抑制卵巢組織萎縮，改善DOR大鼠卵巢功能，減緩衰退進(jìn)程，且育腎助孕方對(duì)卵巢功能的改善效果與其藥物濃度有關(guān)。