武靜橋，吳玉姝，范真瑋，姚景麗，何敬文，陳 婷，趙 微，駱紫冰，張東超，金天明

(天津農(nóng)學(xué)院 天津市畜禽病原檢測(cè)與基因疫苗技術(shù)工程中心，天津市西青區(qū) 300380)

肝癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，肝硬化、病毒性肝炎、黃曲霉毒素、激素調(diào)節(jié)異常均可導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率極高且預(yù)后情況不理想，使得5年總體生存率低于5%[1]。其中，肝細(xì)胞癌占全部肝癌的85%[2]，臨床早期無(wú)明顯特征表現(xiàn)，一旦確診常為中晚期，其發(fā)生發(fā)展的生物過(guò)程極其復(fù)雜。臨床中可用的靶標(biāo)有限，因此，研究診斷、治療及預(yù)后的作用機(jī)制顯得尤其為重要。異?；虻谋磉_(dá)常與預(yù)后不良顯著相關(guān)，利用生物信息學(xué)可尋找預(yù)測(cè)肝癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制，為癌癥早期診斷、患者生存檢測(cè)提供重要意義，且對(duì)臨床數(shù)據(jù)的再分析可為患者制定新的診斷和治療策略。在這項(xiàng)研究中，旨在通過(guò)生物信息學(xué)分析方法來(lái)鑒定與肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的分子生物標(biāo)志物，從而為HCC的個(gè)體化治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芯片 肝癌芯片GSE144269、GSE101685選自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)平臺(tái)下的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)GEO DataSets(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)。

1.1.2 芯片數(shù)據(jù) 芯片GSE144269基于GPL24676平臺(tái)，Illumina NovaSeq 6000 (Homo sapiens)包含70例正常組織，70例肝癌組織的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)。芯片GSE101685基于GPL570平臺(tái)，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array包含8例正常組織，24例肝癌組織的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)性分析及主成分分析 利用Pearson相關(guān)系數(shù)以及主成分分析(PCA)，驗(yàn)證每組中組內(nèi)數(shù)據(jù)的相關(guān)程度。

1.2.2 差異表達(dá)基因篩選 利用Rstudio(4.0.2)中的limma包對(duì)下載的芯片數(shù)據(jù)分別做差異表達(dá)基因(DEGs)篩選。以P value<0.01，|logFC|>1.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選出DEGs進(jìn)行后續(xù)分析，并利用Rstudio中的Heatmap包繪制熱圖，利用ggplot2包繪制火山圖。

1.2.3 繪制韋恩圖篩選共有差異基因 使用Venny 2.1在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)識(shí)別2個(gè)數(shù)據(jù)集中共有的上調(diào)和下調(diào)DEGs。

1.2.4 基因功能富集和通路富集 利用Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共有的DEGs進(jìn)行注釋、可視化和綜合探索，以H.sapiens為背景，對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集，以尋找DEGs富集的關(guān)鍵通路。

1.2.5 差異表達(dá)基因的相互作用分析 將兩芯片共同的DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)構(gòu)建DEGs的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種為Homo sapiens，“可信度”為0.96，并應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析。使用插件MCODE進(jìn)行模塊分析，以degree cut_off為10，haircut on，node scare cut-off 為0.2，k-core為2及max depth為100篩選重要模塊。使用CytoHubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行MCC分析并排序。

1.2.6 表達(dá)差異基因的生存分析及預(yù)后價(jià)值分析 利用 GEPIA (http://gepia.cancerpku.cn/)在線分析工具繪制關(guān)鍵基因在肝癌和癌旁組織的表達(dá)情況以及隨肝癌分期的變化情況。利用Kalpan Meier-Plotter(http://kmplot.com/analysis/)在線軟件，分析關(guān)鍵基因?qū)?yīng)肝癌患者的總生存期(OS)，根據(jù)肝癌患者基因的表達(dá)情況及中位值分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，并計(jì)算危險(xiǎn)比(HR)及其95%置信區(qū)間和對(duì)應(yīng)的P值，繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)性分析

利用Pearson相關(guān)系數(shù)分析組間各數(shù)據(jù)的相關(guān)性，并繪制相關(guān)性熱圖，結(jié)果顯示，GSE14429肝癌組內(nèi)和癌旁正常組內(nèi)相關(guān)性均較好，相關(guān)性均在0.78以上。但GSE101685芯片中肝癌組織GSM2171027與其他樣本相關(guān)性較差，肝癌組內(nèi)其他數(shù)據(jù)以及癌旁正常組內(nèi)相關(guān)性均在0.78以上。

利用Rstudio中的ggbiplot 包繪制PCA，結(jié)果顯示：肝癌組和癌旁正常組可以區(qū)分開(kāi)，同一組樣本可以聚合在一起。

2.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理與差異分析

GSE144269篩選出738個(gè)上調(diào)基因，1543個(gè)下調(diào)基因，共2281個(gè)差異表達(dá)基因；GSE101685篩選出288個(gè)上調(diào)基因，455個(gè)下調(diào)基因，共743個(gè)差異表達(dá)基因。DEG的火山圖見(jiàn)圖1，分別以P<0.05和P<0.01以及LogFC=1和LogFC=1.5為界，圖最左(綠色)為下調(diào)基因，圖最右(紅色)為上調(diào)基因。

圖1 基因的表達(dá)水平及分布火山圖Fig.1 Volcanic map of gene expression level and distribution

2.3 共有差異基因

研究中，利用93例HCC樣本和78例正常肝樣本，將得到的差異基因繪制韋恩圖，得到上調(diào)基因149個(gè)，下調(diào)基因304個(gè)，共有453個(gè)DEGs。

2.4 基因富集分析

運(yùn)用Metascape對(duì)453個(gè)DEGs進(jìn)行GO富集分析，可見(jiàn)生物學(xué)過(guò)程(BP)上調(diào)主要富集在細(xì)胞分裂、參與有絲分裂的微管細(xì)胞骨架組織、細(xì)胞周期G1/S相變、細(xì)胞周期的正調(diào)控、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂的調(diào)控；下調(diào)主要富集在一元羧酸代謝過(guò)程、有機(jī)酸分解過(guò)程、類(lèi)固醇代謝過(guò)程、細(xì)胞激素代謝過(guò)程、環(huán)氧酶P450途徑、輔酶代謝過(guò)程；細(xì)胞組成(MF)主要集中在微管結(jié)合、激酶結(jié)合、DNA催化活性、酶抑制劑活性、組蛋白激酶活性、染色質(zhì)結(jié)合；下調(diào)主要集中在氧化還原酶活性、單加氧酶活性、氧化還原酶活性、維生素結(jié)合、酰胺結(jié)合；分子功能(CC)上調(diào)主要富集在染色體、著似粒區(qū)、紡錘體、紡錘體極體、中心體、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物；下調(diào)主要富集在血液微粒、膜攻擊復(fù)合體、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、血漿脂蛋白顆粒、胰島素樣生長(zhǎng)因子三元復(fù)合物。

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)主要富集在細(xì)胞周期、P53信號(hào)通路、ECM受體相互作用、DNA復(fù)制、范可尼貧血通路。下調(diào)主要富集在視黃醇代謝、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、色氨酸代謝、類(lèi)固醇激素的合成、花生四稀酸代謝、咖啡因代謝、膽汁分泌。

2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分析

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape構(gòu)建DEGs之間的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，去除游離的蛋白質(zhì)影響，為453個(gè)DEGs PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)。插件MCODE對(duì)其中重要的模塊分析發(fā)現(xiàn)該模塊分?jǐn)?shù)為23.571。利用CytoHubba 插件中的MCC算法對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，取其中評(píng)分最高的前10個(gè)基因作為核心基因，分別是：BUB1、AURKB、CDC20、CCNB1、CCNPE、CDCA8、CDK1、CCNB2、BUB1B、KIF2C。利用Metascape對(duì)10個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通路仍舊富集在細(xì)胞周期、減數(shù)分裂等途徑中。

2.6 預(yù)后價(jià)值分析

利用在線工具Kaplan Meier-Plotter對(duì)關(guān)鍵模塊中的10個(gè)DEGs進(jìn)行預(yù)后價(jià)值評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，除CENPE基因外，其他關(guān)鍵基因均在肝癌組織中呈現(xiàn)顯著性高表達(dá)(P<0.001)。分期結(jié)果顯示，關(guān)鍵基因隨TNM分期的進(jìn)展明顯降低，總體趨勢(shì)為分期越高其表達(dá)水平越低。

3 討論

肝細(xì)胞癌是一種異質(zhì)性惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率和死亡率較高。本研究利用生物學(xué)信息方法分析GSE144269與GSE101685芯片，篩選肝癌組織與癌旁正常組織間的差異，獲得上調(diào)149個(gè)，下調(diào)304個(gè)，共453個(gè)DEGs。GO和KEGG分析結(jié)果顯示，DEGS上調(diào)基因主要集中在細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期G1/S相變、細(xì)胞周期的正調(diào)控、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂的調(diào)控等生物過(guò)程，反映了肝癌組織中細(xì)胞增殖紊亂，細(xì)胞凋亡調(diào)控異常等情況。已有研究證明，細(xì)胞周期失調(diào)是癌癥的標(biāo)志[3]，因此，靶向細(xì)胞周期通路可能是治療癌癥的有效策略。下調(diào)主要富集在一元羧酸代謝過(guò)程、有機(jī)酸分解過(guò)程、類(lèi)固醇代謝過(guò)程、環(huán)氧酶P450途徑、輔酶代謝生物過(guò)程，涉及營(yíng)養(yǎng)、外來(lái)物質(zhì)代謝等途徑，推測(cè)是由于肝臟功能受損，導(dǎo)致肝功能紊亂，影響細(xì)胞內(nèi)氧化還原造成的。KEGG通路富集結(jié)果顯示，DEGs顯著富集于細(xì)胞周期、P53信號(hào)通路、DNA復(fù)制、范可尼貧血通路、視黃醇代謝、色氨酸代謝等信號(hào)通路。色氨酸代謝紊亂與腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移相關(guān)，癌變細(xì)胞的細(xì)胞周期及DNA復(fù)制失調(diào)與腫瘤增殖相關(guān)，50%的惡性腫瘤中P53信號(hào)通路會(huì)發(fā)生突變，范可尼貧血突變會(huì)改變DNA修復(fù)過(guò)程中的同源重組，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，增加了癌細(xì)胞對(duì)各種癌癥的敏感性。由此可見(jiàn)，通路主要富集在DNA復(fù)制與細(xì)胞周期通路中。

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵模塊的基因與其他基因存在大量的相互作用，利用插件CytoHubba篩選出10個(gè)關(guān)鍵基因，并利用CEPIA進(jìn)行肝癌與癌旁組織的基因表達(dá)量以及腫瘤分期的分析，結(jié)果顯示，除CENPE基因腫瘤與癌旁組織基因表達(dá)差異未達(dá)到顯著差異外，其他關(guān)鍵基因均在肝癌組織中具顯著性差異表達(dá)，且關(guān)鍵基因均與TNM分期和預(yù)后明顯相關(guān)。

細(xì)胞分裂周期蛋白CDC20是紡錘體裝配檢查點(diǎn)蛋白(SAC)的關(guān)鍵組成部分，其異常表達(dá)與胃癌，胰腺癌、前列腺癌等類(lèi)型的癌癥惡性進(jìn)展和預(yù)后不良有關(guān)[4]。敲低CDC20基因可抑制胰腺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移[5]，因此，開(kāi)發(fā)CDC20的靶標(biāo)抑制劑是可能研究抑制腫瘤轉(zhuǎn)移新方向。激光激酶B(AURKB)也是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是有絲分裂過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一，與AURKA、AURKC共同控制哺乳動(dòng)物有絲分裂和減數(shù)分裂期間染色體的劃分和分離，研究顯示，AURKB在肝癌中過(guò)表達(dá)[6]，與我們得到的結(jié)果一致。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶BUB1作為BUB家族成員之一，通過(guò)參與組裝紡錘體組裝檢查點(diǎn)(SAC)以保證姐妹染色單體正確分離，在有絲分裂期間與著絲粒結(jié)合，高表達(dá)與細(xì)胞周期以及肝癌患者的OS降低有關(guān)[7]，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BUB1在胰腺導(dǎo)管腺癌和卵巢癌上調(diào)并促進(jìn)癌癥的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。紡錘體檢測(cè)蛋白BUB1B是主要的紡錘體檢測(cè)點(diǎn)，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，可能導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性，在胃癌、前列腺癌、乳腺癌中高表達(dá)并促進(jìn)癌癥進(jìn)展[9]，在結(jié)腸癌和肺癌中BUB1B低表達(dá)導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移并降低生存率[10]。BUB1和BUB1B異常高表達(dá)可以促進(jìn)HCC的增殖和轉(zhuǎn)移情況[11]，與我們目前的得到的結(jié)果一致。已經(jīng)驗(yàn)證BUB1B激活MTORC1通路，引起下游效應(yīng)因子BAX的高表達(dá)、活化的caspase3高表達(dá)以及Bcl2，CDK2，CDK4，CDK6的低表達(dá)[12]。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK1是細(xì)胞周期的主要調(diào)節(jié)劑，對(duì)真核細(xì)胞周期的G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換至關(guān)重要[13]，抑制CDK1的表達(dá)可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。miR-582-5p通過(guò)靶向CDK1和AKT3可抑制HCC的進(jìn)程[15]。這些數(shù)據(jù)表明CDK1可以作為預(yù)測(cè)HCC生存的潛在生物標(biāo)志物。

B型細(xì)胞周期蛋白家族包括CCNB1和CCNB2 且兩者大多數(shù)共表達(dá)在分裂的細(xì)胞中，并與CDK1形成復(fù)合物啟動(dòng)有絲分裂程序；CCNB1蛋白作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑和G2/M期啟動(dòng)子，參與促進(jìn)細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)、癌癥復(fù)發(fā)等過(guò)程，在腫瘤侵襲中起關(guān)鍵作用[16]；CCNB2的異常表達(dá)可能導(dǎo)致G2/M檢查點(diǎn)受損，繼而導(dǎo)致DNA損傷和突變。Zhang H等證明CCNB1沉默可以通過(guò)激活P53信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

KIF2C屬于驅(qū)動(dòng)蛋白超家族蛋白，在遷移和侵襲過(guò)程中參與細(xì)胞骨架重塑過(guò)程，被認(rèn)為是乳腺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的癌基因[18]。KIF2C在HCC中高表達(dá)加劇了HCC的進(jìn)展[19]，突出了我們數(shù)據(jù)的可信度，強(qiáng)調(diào)了KIF2C作為治療HCC的有希望的治療靶點(diǎn)的潛力。細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白8(CDCA8)涉及蛋白質(zhì)代謝和有絲分裂過(guò)程，參與腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展，并導(dǎo)致肝癌，胃癌和肺癌的不良預(yù)后[20]。CDCA8的siRNA沉默通過(guò)阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，抑制了HCC腫瘤的生長(zhǎng)[21]，表明靶向CDCA8可能是HCC分子治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，肝癌組織中BUB1、AURKB、CDC20、CCNB1、CDCA8、CDK1、CCNB2、BUB1B、KIF2C的上調(diào)與肝癌相關(guān)，可能是新的生物標(biāo)志物，并有望成為肝癌的治療靶標(biāo)。各種細(xì)胞周期蛋白及紡錘體、染色體蛋白的異常激活導(dǎo)致非機(jī)體控制的增殖是肝癌的特性之一。因此，深入研究細(xì)胞分裂相關(guān)基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制，對(duì)肝癌的治療具有廣闊的前景。在大多數(shù)腫瘤中，p53基因通過(guò)其相關(guān)途徑的突變或降解而失活，本研究將在后續(xù)研究中利用MEL蜂毒肽以及不依賴P53途徑的Apoptin蛋白，在細(xì)胞水平及動(dòng)物模型上抑制肝癌細(xì)胞的增殖以達(dá)到抑制肝癌的目的，并進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，為預(yù)防肝癌的發(fā)生以及抑制肝癌的惡性進(jìn)展提供理論依據(jù)。