于思慧，單朝萌，文雪霞，張 瑩

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院/東北畜禽疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110161)

先天性免疫是動(dòng)物機(jī)體抵抗病原微生物感染的第一道防線，同時(shí)也是激活適應(yīng)性免疫的必要條件，對動(dòng)物機(jī)體抵御外界微生物感染至關(guān)重要。當(dāng)外界病原微生物入侵動(dòng)物機(jī)體時(shí)，先天性免疫細(xì)胞通過其表面的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，最終促進(jìn)Ⅰ型干擾素和促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，啟動(dòng)細(xì)胞自主防御機(jī)制。

cGAS-STING信號通路是先天性免疫的重要組成部分。該信號通路包括環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)和干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)兩個(gè)主要因素。病原入侵宿主細(xì)胞時(shí)會釋放各種病原相關(guān)分子模式，病毒和細(xì)菌的雙鏈DNA是非常重要的PAMPs，它們可激活cGAS，使其構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而催化合成環(huán)鳥嘌呤核苷酸腺嘌呤核苷酸(2′,3′-cyclic GMP-AMP，cGAMP)。cGAMP行使第二信使功能，結(jié)合并激活STING，活化的STING可招募并活化細(xì)胞內(nèi)TANK連接激酶1(TANK binding kinase-1，TBK1)。而TBK1可磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)，使其活化形成二聚體并易位至細(xì)胞核，從而激活I(lǐng)型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄。此外，cGAS-STING信號通路也可通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。論文對cGAS-STING信號通路激活先天性免疫的分子機(jī)制及病毒通過該信號通路調(diào)控機(jī)體先天性免疫策略的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為研究cGAS-STING信號通路及其與病毒間的相互作用提供參考。

1 cGAS-STING信號通路介導(dǎo)先天性免疫

1.1 cGAS的激活

宿主細(xì)胞的PRRs識別細(xì)胞不同部位的PAMPs，是觸發(fā)先天性免疫反應(yīng)的第一步。cGAS作為一種模式識別受體，主要識別胞質(zhì)DNA。外源病原微生物DNA是激活cGAS的主要誘因。除此之外，cGAS也可以識別各種類型的內(nèi)源性DNA，包括細(xì)胞核DNA和線粒體來源的胞質(zhì)DNA[1]。cGAS通常存在于細(xì)胞質(zhì)中，也定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核。但在細(xì)胞核中，cGAS暴露于染色體DNA時(shí)，如何區(qū)分染色體DNA和與感染相關(guān)的DNA，阻止其識別自身DNA，或使其駐留在核中卻保持失活的機(jī)制尚不清楚。

cGAS含有核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和2個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[2]。沒有DNA存在時(shí)，cGAS處于失活狀態(tài)。當(dāng)與DNA結(jié)合后，cGAS形成二聚體，并與兩個(gè)雙鏈DNA分子形成2∶2復(fù)合物(圖1)，暴露出2個(gè)酶活性位點(diǎn)[2,3]。DNA結(jié)合并激活cGAS與其長度密切相關(guān)，DNA的長度越長，其激活cGAS的效力越強(qiáng)[4-6]。理論上，16 bp～18 bp的DNA足以激活cGAS。但是，在體外誘導(dǎo)cGAS催化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，小于20 bp的DNA與cGAS催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合較弱。只有在cGAS濃度很高的情況下，小于20 bp的DNA才能有效誘導(dǎo)cGAS的催化活性[2,7]，較短的雙鏈DNA在低cGAS濃度時(shí)無法有效激活cGAS的原因可能是 cGAS濃度較低時(shí)不會形成二聚體。有意思的是，結(jié)合并激活不同物種cGAS活性的DNA長度存在差異。相較于人源cGAS，短的雙鏈DNA更易激活鼠源cGAS的催化活性[8]。研究表明，即使人源cGAS濃度很高，長度小于40 bp的DNA也無法激活人源cGAS的酶活性[4-5]。

cGAS被激活后催化生成2′,3′-cGAMP，該過程涉及在同一催化位點(diǎn)進(jìn)行兩個(gè)不同的化學(xué)反應(yīng)。第一步，cGAS以三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和三磷酸鳥苷 (guanosine triphosphate,GTP)為底物，將ATP轉(zhuǎn)移到GTP的2′OH上，生成線性異二核苷酸磷酸酯pppG(2′-5′)pA。第二步，cGAS以線性pppG(2′-5′)pA為底物，將GTP部分分子轉(zhuǎn)移到腺苷磷酸核苷的3′OH上[1]。cGAMP是第一個(gè)在多細(xì)胞生物中發(fā)現(xiàn)的環(huán)二核苷酸，在胞質(zhì)DNA識別過程中發(fā)揮第二信使的功能，可以結(jié)合并激活STING[9]。

環(huán)狀GMP-AMP合酶(cGAS)識別DNA配體并被其激活形成二聚體，活化的cGAS產(chǎn)生環(huán)狀二核苷酸2′,3′-環(huán)狀GMP-AMP(2′,3′-cGAMP)。cGAMP結(jié)合干擾素基因刺激物(STING)，使其激活TBK1磷酸化IRF3。IRF3磷酸化后形成二聚體易位至細(xì)胞核激活Ⅰ型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄。cGAS-STING信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也通過NF-κB(虛線)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。方框中為本文介紹到的經(jīng)由該通路關(guān)鍵蛋白調(diào)控先天性免疫的病毒。Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)recognizes the DNA and then is activated to form dimers.The activated cGAS produces the cyclic dinucleotide 2′,3′-cyclic GMP-AMP (2′,3′-cGAMP),which binds to the stimulator of interferon genes (STING)to activate TBK1 to phosphorylate IRF3.After phosphorylation,IRF3 forms a dimer and translocates to the nucleus to activate the transcription of type I interferon genes.cGAS-STING signal transduction also induces the expression of pro-inflammatory cytokine genes through NF-κB (dotted line).These viruses that mentioned in this article are shown in box regulate innate immunity through key proteins in this pathway introduced.圖1 cGAS-STING信號通路及通過該通路關(guān)鍵蛋白調(diào)控先天性免疫的病毒Fig.1 cGAS-STING signaling pathway and viruses that regulate innate immunity through key proteins in this pathway

1.2 STING的激活

STING是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，部分定位于線粒體和線粒體相關(guān)膜上[10]。其中，N端4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)將其錨定于膜結(jié)構(gòu)上，C端的球狀結(jié)構(gòu)域包括二聚化結(jié)構(gòu)域(dimerization domain，DD)和C端尾結(jié)構(gòu)域(C-terminal tail，CTT)面向細(xì)胞質(zhì)。結(jié)構(gòu)域DD高度保守，對STING遷移至核周區(qū)域、活化下游信號通路非常重要；結(jié)構(gòu)域CTT則主要負(fù)責(zé)招募、活化TBK1和IRF3[11]。STING以二聚體形式結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，兩個(gè)STING分子的跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)生交換，并通過螺旋與朝向細(xì)胞質(zhì)的C端結(jié)構(gòu)域連接。STING二聚體的DD結(jié)構(gòu)域形成一環(huán)狀二核苷酸的V形配體結(jié)合袋[12]。

cGAMP和STING的DD結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，STING二聚體構(gòu)象發(fā)生變化，其DD結(jié)構(gòu)域相對于跨膜部分順時(shí)針旋轉(zhuǎn)180°，這種構(gòu)象變化促進(jìn)STING分子并排進(jìn)行側(cè)向寡聚化。研究發(fā)現(xiàn)，人源STING的寡聚化由連接跨膜結(jié)構(gòu)域和DD結(jié)構(gòu)域螺旋中148位半胱氨酸促進(jìn)，表明STING活化幾乎不可逆[1]。STING的寡聚化決定STING在細(xì)胞內(nèi)亞定位的改變[13-14]。結(jié)合cGAMP后，STING發(fā)生寡聚化的同時(shí)，其在細(xì)胞內(nèi)的亞定位也從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，后又至細(xì)胞核周圍，并形成大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。布雷非德菌素A能夠抑制STING的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制下游信號通路的激活，這說明STING的易位對于其信號通路的激活非常必要[15]。STING易位在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性意味著STING的跨膜結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)其活性中也發(fā)揮重要作用。

1.3 IRF3的激活

從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至核外周小體后，STING發(fā)生磷酸化修飾[15]。STING蛋白CTT結(jié)構(gòu)域包含一高度保守的TBK1結(jié)合基序[16-17]，通過該基序STING可與TBK1結(jié)合。IRF3結(jié)合基序(pLxIS基序)緊鄰TBK1基序，與IRF3激活密切相關(guān)[18-19]。研究表明，穩(wěn)態(tài)條件下，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的非活化STING二聚體上已結(jié)合了大量的TBK1[17]。但是，該狀態(tài)下存在空間位阻，阻止TBK1發(fā)生反式磷酸化，故這些TBK1未被激活[1]。

當(dāng)STING和cGAMP結(jié)合發(fā)生寡聚化時(shí)，其CTT結(jié)構(gòu)域上結(jié)合的“順式”TBK1分子與相鄰二聚體的“反式”TBK1分子緊鄰，“反式”TBK1分子的環(huán)可接近“順式”分子激酶結(jié)構(gòu)域的催化中心，使得TBK1可以反式磷酸化并激活緊密相鄰的TBK1分子?；罨腡BK1催化STING磷酸化，使其CTT結(jié)構(gòu)域上pLxIS基序(p代表親水性氨基酸，L代表亮氨酸，x代表任意氨基酸，I代表異亮氨酸，S代表絲氨酸)的絲氨酸殘基磷酸化，pLxIS基序即成為IRF3的結(jié)合位點(diǎn)[19]。研究表明，TBK1僅能磷酸化相鄰STING二聚體的CTT結(jié)構(gòu)域，而對與其結(jié)合STING二聚體的CTT結(jié)構(gòu)域則無此作用。STING被磷酸化后，通過pLxIS基序與IRF3結(jié)合，由于pLxIS基序緊靠具有催化活性的TBK1分子，IRF3可被緊靠的TBK1磷酸化[13,16]。隨后，IRF3發(fā)生二聚化后進(jìn)入細(xì)胞核，與共同活化因子CBP/p300(CREB binding protein/adenoviral E1A binding protein of 300 ku)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，最終激活I(lǐng)型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄。

1.4 STING通路激活NF-κB

目前，STING介導(dǎo)的cGAS-STING通路激活NF-κB的機(jī)制尚不明確。一方面，研究表明TBK1在NF-κB活化的上游起作用[20-21]。另一方面，也有研究表明該功能不需要STING的CTT結(jié)構(gòu)域[15,22]，說明激活NF-κB不需要TBK1發(fā)揮作用。激活不含CTT結(jié)構(gòu)域的STING，仍會激活NF-κB。因此，STING活化NF-κB可能受到寡聚化STING的DD結(jié)構(gòu)域的調(diào)控[15,22]。

2 病毒通過cGAS-STING信號通路調(diào)控先天性免疫

cGAS-STING信號通路由兩個(gè)重要因素構(gòu)成，即cGAS和STING。病毒激活信號通路后，通過不同作用靶點(diǎn)影響信號通路發(fā)揮作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)，許多病毒可靶向STING蛋白調(diào)控該信號通路誘導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，一些病毒可通過該信號通路上蛋白分子cGAS、TBK1調(diào)控先天性免疫。

2.1 病毒靶向cGAS調(diào)控先天性免疫

cGAS是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)DNA感受器，許多DNA病毒，包括皰疹病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒等均可以調(diào)控cGAS-STING信號通路，但通過靶向作用于cGAS蛋白影響信號通路激活的病毒較少。人類皰疹病毒8型(Human herpes virus 8，HHV-8)，即卡波濟(jì)氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)為一種嚴(yán)重威脅人類健康的皰疹病毒。該病毒編碼的ORF52蛋白可通過與被感染宿主細(xì)胞的cGAS結(jié)合，直接抑制cGAS的酶活性[23]。ORF52蛋白也可與cGAS競爭性結(jié)合DNA底物[24]。cGAS活性受到抑制，cGAS-STING信號通路無法啟動(dòng)，其下游STING-IRF3的功能不能發(fā)揮，先天性免疫受到抑制，導(dǎo)致機(jī)體清除病毒的能力減弱。其他皰疹病毒，如羅斯河病毒(Ross river virus，RRV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)的ORF52蛋白同源物也具有類似作用[23]。

2.2 病毒靶向STING調(diào)控先天性免疫

許多病毒可通過和STING互相作用，導(dǎo)致下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，從而逃避機(jī)體先天性免疫，但不同病毒和STING相互作用機(jī)制不盡相同。下面分別從DNA病毒和RNA病毒兩方面闡述其具體機(jī)制。

皰疹病毒是一類具有囊膜的DNA病毒，已有研究發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒編碼的多種蛋白均可拮抗cGAS-STING通路的激活，從而逃避宿主先天性免疫。單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)是皰疹病毒的代表種，也是已報(bào)道的第一種在體內(nèi)外均可激活STING的DNA病毒，在試驗(yàn)系統(tǒng)中被廣泛用作cGAS-STING通路的激活劑。敲除STING的小鼠感染HSV-1后，機(jī)體I型干擾素產(chǎn)生受到抑制，最終導(dǎo)致死亡[25]。除ORF52蛋白靶向cGAS外，KSHV編碼的另一蛋白，干擾素調(diào)節(jié)因子1也可與STING相互作用，阻止STING與TBK1結(jié)合，進(jìn)而抑制STING磷酸化[26]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)聚合酶是唯一抑制STING介導(dǎo)的β干擾素(interferon-β，IFN-β)啟動(dòng)子激活的HBV編碼蛋白。HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶或RNase H結(jié)構(gòu)域可抑制STING信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[27]。人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一種普遍存在的DNA病毒。HPV編碼的E7蛋白可與STING結(jié)合，從而有效抑制DNA激活的抗病毒反應(yīng)，且研究發(fā)現(xiàn)，E7蛋白與成視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)結(jié)合的LXCXE基序(L代表亮氨酸，X代表任意氨基酸，C代表半胱氨酸，E代表谷氨酸)對于拮抗cGAS-STING通路的激活也是必需的。缺失E7蛋白的HPV毒株感染可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生大量的I型干擾素[28]。與HPV的E7蛋白類似，腺病毒編碼的E1A蛋白也可通過其LXCXE基序拮抗STING功能，抑制DNA病毒誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)[28]。

冠狀病毒是自然界廣泛存在的一大類RNA病毒。研究發(fā)現(xiàn)，人冠狀病毒NL63(Human coronavirus NL63，HCoV-NL63)Nsp3蛋白膜定位的木瓜樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域2(papain like protease 2-transmembrane domain，PLP2-TM)與STING共定位并相互作用[29]。PLP2-TM可阻止STING二聚體的形成以及STING-TBK1相互作用，且可減弱STING的K63泛素化修飾。豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)編碼的Nsp3蛋白PLP2結(jié)構(gòu)域也已報(bào)道可與STING相互作用并抑制STING的K63泛素化修飾。但是，兩種病毒Nsp3發(fā)揮抑制作用的機(jī)制稍有差異，HCoV-NL63的Nsp3蛋白不一定需要PLP2-TM的去泛素化酶(deubiquitinase，DUB)活性，而對于PEDV而言，DUB活性則是必需的[30]。SARS冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)編碼的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(papain like protease，PLpro)也可抑制STING活化。與HCoV-NL63相似，SARS-CoV的PLpro也負(fù)調(diào)控STING二聚體形成和K63泛素化修飾，提示此功能可能為冠狀病毒科木瓜蛋白酶樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域的保守功能[29,31]。與冠狀病毒類似，黃病毒科病毒也是一類有囊膜的單正鏈RNA病毒。已有研究證明，黃病毒科病毒的NS4B蛋白可通過STING蛋白調(diào)控先天性免疫。黃熱病病毒(Yellow fever virus，YFV)的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B可與STING共定位并相互作用，進(jìn)而阻止STING和視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene-I，RIG-I)依賴的信號傳導(dǎo)[32]。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)NS4B蛋白與STING相互作用，阻止STING和TBK1結(jié)合[33]。NS4B也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的STING共定位從而減弱STING-TBK1的相互作用。此外，同皰疹病毒一樣，黃病毒也進(jìn)化出不同的機(jī)制來阻斷STING激活。登革病毒(Dengue virus，DENV)編碼的NS2B/3蛋白可作用于人源STING蛋白第93位至第96位氨基酸(LRRG)對其進(jìn)行裂解和降解。鼠源STING蛋白無該氨基酸序列，故NS2B/3蛋白不能裂解鼠源STING蛋白，繼而也不可阻斷cGAS-STING信號通路誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生[34]。

2.3 病毒靶向TBK1調(diào)控先天性免疫

細(xì)胞內(nèi)多條誘導(dǎo)先天性免疫的信號通路需要TBK1蛋白的參與。本文主要闡釋病毒通過cGAS-STING信號通路靶向TBK1調(diào)控先天性免疫應(yīng)答的機(jī)制。HSV-1的皮層蛋白UL46是HSV-1拮抗宿主抗病毒免疫應(yīng)答的重要蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，UL46在外源表達(dá)和病毒感染時(shí)均不能影響STING的表達(dá)，而是直接與STING下游TBK1相互作用，抑制TBK1的活化，削弱TBK1與IRF3的相互作用，阻礙TBK1對IRF3的激活，從而阻斷干擾素的產(chǎn)生[35]。

3 展望

cGAS-STING信號通路的發(fā)現(xiàn)和研究使人們對細(xì)胞感應(yīng)、識別外源DNA從而誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)分子抑制外源微生物感染的機(jī)制有了更為全面和深入的理解和認(rèn)識。雖然，關(guān)于該方面的研究不斷取得重要進(jìn)展，但是仍有很多科學(xué)問題有待進(jìn)一步闡釋。諸如，cGAS-STING信號通路不僅可識別病毒DNA，還可識別自身DNA。但是，目前尚不清楚cGAS在細(xì)胞核中如何區(qū)分染色體DNA和與感染相關(guān)的DNA，進(jìn)而阻止對自身DNA的識別。病毒在感染宿主過程中，不斷進(jìn)化出各種策略拮抗宿主的先天性免疫反應(yīng)。深入研究不同病毒逃逸機(jī)體先天性免疫機(jī)制，一方面有利于解析病毒的致病機(jī)理，從而開發(fā)有效的疫苗和藥物；另一方面有助于全面透徹理解宿主的先天性免疫反應(yīng)。