韓冬月，姚妮，王楚茵，方芳，關(guān)君

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

許多慢性疾病，如阿爾茨海默病、糖尿病、帕金森病等都與人體氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1?5]，自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量生成或抗氧化防御系統(tǒng)能力下降是引起人體氧化應(yīng)激的主要因素[6?7]。天然抗氧化劑因其能夠清除人體代謝所產(chǎn)生的自由基或ROS，且具有一定的藥用價(jià)值而受到越來越多的關(guān)注。但是，由于單一成分的天然抗氧化劑大多活性較弱，而且當(dāng)其處于高劑量或是缺少協(xié)同物時(shí)往往表現(xiàn)出助氧化活性甚至產(chǎn)生毒性[8]，因此人們開始重視抗氧化協(xié)同作用的研究[9]。根據(jù)“中藥有效化學(xué)成分的配位化學(xué)學(xué)說”，某些中藥活性成分可與金屬離子配位，或產(chǎn)生原本不具備的新活性，或產(chǎn)生協(xié)同作用，或降低不良反應(yīng)，或解除過量的金屬離子導(dǎo)致的中毒狀態(tài)[10?11]。這種具有配位能力的中藥活性成分稱為“配體類中藥”。具有抗氧化活性的“配體類中藥”與金屬離子配位后可以影響其自身的抗氧化活性，如金雀異黃酮和山柰酚與Cu2+配位后抗氧化活性增強(qiáng)[12]；大黃素與Mg2+配位后抗氧化活性增強(qiáng)[13]；平貝母多糖與Fe3+配位后抗氧化活性增強(qiáng)[14]等，這為尋找具有協(xié)同作用的抗氧化劑提供了重要的研究思路。

蘆薈大黃素（aloe?emodin，AE），化學(xué)名為1,8?二羥基?3?羥甲基蒽醌，屬蒽醌類成分，在中藥大黃、蘆薈、決明子中多有分布，具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[15?19]。在分子結(jié)構(gòu)方面，由于AE 具有2 個(gè)酚羥基，因此具備對(duì)超氧陰離子自由基及羥自由基的強(qiáng)清除作用[20]。AE 具有鄰近的1，8 位羥基和9 位羰基，以及完整的大π 鍵共軛體系，因此具備與金屬離子螯合配位的能力，可以作為“配體類中藥”使用?；谏鲜? 個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，AE 可能成為一種具有抗氧化活性的“配體類中藥”。目前，AE 類配合物的研究大多關(guān)注于Fe3+、Fe2+、Cu2+、Mg2+等內(nèi)源性金屬離子[21?22]，對(duì)外源性金屬離子Al3+卻少有報(bào)道。而Al3+是一種強(qiáng)神經(jīng)毒素[23]，能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激中ROS 和自由基的生成[24?25]，導(dǎo)致神經(jīng)元的氧化損傷，與阿爾茨海默病、糖尿病等多種氧化應(yīng)激性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[26?30]。因此，基于“中藥有效化學(xué)成分的配位化學(xué)學(xué)說”，本研究假設(shè)AE 可通過與Al3+螯合配位，一方面降低Al3+的毒性以抑制自由基的產(chǎn)生，另一方面新形成的螯合物也很可能具有一定清除自由基的能力，從而發(fā)揮協(xié)同抗氧化作用，進(jìn)而起到有效治療氧化應(yīng)激性疾病的作用。

為驗(yàn)證假設(shè)，本研究首次合成并表征蘆薈大黃素?鋁（AE?Al）螯合物，通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)探討其對(duì)1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（1,1?dipheny1?2?picryl?hydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除能力，從而對(duì)其協(xié)同抗氧化作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為“配體類中藥”治療氧化應(yīng)激性疾病提供思路，為天然抗氧化劑的研究提供借鑒。

1 材料

DF?101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；YP10002 型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；FE20 型pH 計(jì)[梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司]；DZF?6020 型真空干燥機(jī)（北京星德儀器設(shè)備有限公司）；Sorvall ST 8R 型高速冷凍離心機(jī)、Nicolet iS10 型紅外光譜儀（美國(guó)賽默飛公司）；TU?1901 型雙光束紫外?可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；700M型核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司）。

AE（純度≥95%，上海源葉生物科技有限公司）；無(wú)水氯化鋁[九鼎化學(xué)（上海）科技有限公司]；溴化鉀（KBr，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氘代二甲基亞砜（DMSO?D6，比利時(shí)Acros公司）；水楊酸[福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司]；無(wú)水硫酸亞鐵（FeSO4）、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均購(gòu)自羅恩試劑公司；氨水、無(wú)水甲醇、鹽酸（HCl）、乙醚、過氧化氫（H2O2）均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 螯合物的合成

精密稱定AE 0.243 g（0.9 mmol）溶于適量無(wú)水甲醇中，40 ℃電磁加熱攪拌溶解，待大部分AE溶解，將用適量無(wú)水甲醇溶解的0.3 mmol AlCl3逐滴加入AE 的無(wú)水甲醇中，混合攪拌15 min 后用氨水甲醇溶液（1∶1）調(diào)節(jié)pH為7.35～7.45，此時(shí)溶液變渾濁，呈紅棕色，繼續(xù)40 ℃電磁加熱攪拌8 h后靜置24 h，得螯合物沉淀，將沉淀用無(wú)水甲醇離心洗滌5 次后再用乙醚離心洗滌5 次（3000 r·min-1離心5 min，離心半徑為7 cm），40 ℃真空干燥72 h，得紅棕色粉末狀固體。

2.2 螯合物的表征

2.2.1 紫外?可見分光光譜分析 用無(wú)水甲醇溶解AE 及AE?Al 螯合物至2×10-5mol·L-1，在波長(zhǎng)200～600 nm進(jìn)行掃描。AE及AE?Al螯合物紫外數(shù)據(jù)見表1、圖1，AE 在225、254、286、428 nm 處有強(qiáng)吸收帶。225 nm 處為苯環(huán)的共軛體系譜帶，254、286 nm 處為醌樣結(jié)構(gòu)形成的吸收帶，428 nm 處為醌羰基吸收帶。AE?Al螯合物的紫外光譜圖與AE 相比，吸收峰的形狀沒有太大變化，但吸收峰在225 nm處發(fā)生1 nm的輕微紅移，在428 nm處發(fā)生2 nm的紅移，且吸收峰的強(qiáng)度增大。428 nm 處為AE 醌羰基形成的吸收帶，螯合物在此處發(fā)生紅移說明醌羰基參與了配位成鍵，且形成螯合物的同時(shí)沒有破壞蒽醌環(huán)的骨架[21]。峰位移動(dòng)的原因可能為形成螯合物后，分子中電子的離域程度增大，致使電子躍遷時(shí)所需能量降低，吸收峰紅移。螯合物在237、514 nm 處出現(xiàn)新的紫外吸收帶，推測(cè)是由于鋁配位成鍵形成的吸收帶。

表1 AE及AE-Al螯合物的溶液吸光度

圖1 AE及AE-Al螯合物紫外-可見光譜圖

2.2.2 紅外光譜分析 采用固體KBr 壓片法，在400～4000 cm-1對(duì)AE 及AE?Al 螯合物進(jìn)行紅外光譜掃描。AE 及AE?Al螯合物主要紅外特征峰有明顯差異，具體數(shù)據(jù)見表2、圖2。3300～3500 cm-1為羥基的特征伸縮振動(dòng)峰，AE 及AE?Al螯合物在此區(qū)域均有寬而強(qiáng)的羥基伸縮振動(dòng)峰，在1200～1300 cm-1區(qū)域內(nèi)均有酚羥基的C?O 伸縮振動(dòng)峰，由此可見，在螯合物中有酚羥基的存在。C=O 伸縮振動(dòng)峰在AE中位于1 675.31、1 628.07 cm-1，當(dāng)形成螯合物后，移至低波1 667.59、1 617.41 cm-1處，說明AE 中醌羰基的O 與金屬離子配位，從而引起羰基成鍵電子云密度偏離幾何中心，移向O 原子。分子中C?O 的振動(dòng)頻率也向低波處移動(dòng)，分析其可能為羰基發(fā)生螯合后引起相應(yīng)的變化。Al 元素質(zhì)量較大且配位鍵較弱，因此配位鍵的伸縮振動(dòng)峰一般出現(xiàn)在低頻區(qū)，本實(shí)驗(yàn)中，Al?O的伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在593.28 cm-1處。

圖2 AE及AE-Al螯合物紅外光譜圖

表2 蘆薈大黃素及其螯合物主要特征峰振動(dòng)頻率 cm-1

2.2.3 核磁共振氫譜（1H?NMR）及核磁共振碳譜（13C?NMR）分析 為了進(jìn)一步探討AE 與Al3+的配位情況，本實(shí)驗(yàn)以DMSO?D6 為溶劑，在700 Hz 下測(cè)定AE 及AE?Al 螯合物的1H?NMR 譜圖，167 Hz 下測(cè)定AE及AE?Al螯合物的13C?NMR譜圖。

由AE 及AE?Al 螯合物的1H?NMR 數(shù)據(jù)（表3）可知，AE 的C?1、C?8 位酚羥基峰化學(xué)位移為δ11.89、11.83；而相比AE，AE?Al 螯合物失去1個(gè)酚羥基質(zhì)子峰，僅在δ11.96 出現(xiàn)一弱峰，說明AE 的1 個(gè)酚羥基失去質(zhì)子與Al3+形成螯合物。AE 的C?1、C?8位酚羥基所處空間結(jié)構(gòu)相似，均可與C?9位羰基形成分子內(nèi)氫鍵，而C?3 位羥甲基的給電子效應(yīng)使得C?8位酚羥基更易解離，由此推測(cè)，AE的C?8位氧原子通過C?9位氧原子與Al3+形成螯合物。由于Al3+的吸電子效應(yīng)，使得C?1 位?OH 的電子云密度降低，移向低場(chǎng)，化學(xué)位移升高。

表3 AE及AE-Al螯合物的1H-NMR信息（700 MHz，DMSO）

由AE 及AE?Al 螯合物的13C?NMR 數(shù)據(jù)（表4）可知，兩者13C?NMR 譜變化不大，僅化學(xué)位移發(fā)生微小增加，說明未有新環(huán)境的C生成。由于Al3+的吸電子效應(yīng)，使得電子云密度降低，移向低場(chǎng)，使得化學(xué)位移升高；配位后形成的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，使螯合物的共軛體系增加，共軛效應(yīng)增大，去屏蔽作用增強(qiáng)，移向低場(chǎng)，化學(xué)位移值增大。

表4 AE及AE-Al螯合物的13C-NMR信息（167 MHz，DMSO）

2.2.4 配位比的測(cè)定 采用等摩爾連續(xù)變化法（又稱Job 法）測(cè)定螯合物的配位比。保持AE 與Al3+的濃度之和為2.4×10-4mol·L-1，并連續(xù)改變AE 與Al3+濃度的比值，混合后于40 ℃水浴反應(yīng)90 min后，在514 nm 處測(cè)定吸光度（A），以A為縱坐標(biāo)（Y），AE 的摩爾分?jǐn)?shù)（xR）為橫坐標(biāo)（X）作圖（圖3）。根據(jù)兩邊線性部分的延線相交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的xR，即可求出配位比例。線性回歸方程為Y=0.192 4X-0.002 8（r=0.997 2），Y=-0.421 7X+0.419 3（r=0.997 7），通過計(jì)算可得配位比為AE∶Al3+=2∶1。

圖3 Job法測(cè)定AE-Al螯合物配位比

2.2.5 螯合物的結(jié)構(gòu) 根據(jù)紫外?可見分光光譜、紅外光譜、1H?NMR、13C?NMR、Job 法結(jié)果，推測(cè)AE 通過C?8 位羥基氧和C?9 位羰基氧與Al3+雙齒配位，配位比為2∶1，見圖4。

圖4 蘆薈大黃素-鋁螯合物可能的結(jié)構(gòu)式

2.3 抗氧化活性

2.3.1 對(duì)DPPH 自由基的清除作用 取不同質(zhì)量濃度的AE 及AE?Al 螯合物的無(wú)水甲醇（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1）各2 mL 于試管中，加入25 mg·L-1DPPH?無(wú)水甲醇溶液2 mL，室溫避光反應(yīng)30 min，于516.5 nm 處測(cè)定A[31]，以無(wú)水甲醇代替DPPH?無(wú)水甲醇溶液，測(cè)定A，以蒸餾水代替樣品測(cè)定A。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，按公式（1）計(jì)算DPPH自由基的清除率。

式中A1代表樣品吸光度，A2代表陰性對(duì)照吸光度，A0代表空白對(duì)照吸光度。

結(jié)果如圖5 所示，AE 及AE?Al 螯合物均具有清除DPPH 自由基的能力，且清除率隨濃度增加而增大，具有濃度依賴性。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，螯合物清除DPPH 自由基的能力強(qiáng)于同濃度AE 配體，但總體清除率不高，均低于30%。

圖5 AE及AE-Al螯合物對(duì)DPPH自由基的清除能力（,n=3）

2.3.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定。取Tris?HCl 溶液（50 mmol·L-1，pH=8.2）4.5 mL 于試管中，25 ℃水浴反應(yīng)20 min，加入不同質(zhì)量濃度的AE 及AE?Al螯合物的無(wú)水甲醇（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1）1 mL，加入25 ℃預(yù)熱的3 mmol·L-1鄰苯三酚溶液0.5 mL 于試管中，混合均勻，25 ℃水浴精確反應(yīng)5 min，加入8 mol·L-1鹽酸溶液終止反應(yīng)，于319.5 nm 處測(cè)定A[32]，以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液，測(cè)定A，以蒸餾水代替樣品測(cè)定A。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，按公式（1）計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率。

結(jié)果如圖6 所示，AE 及AE?Al 螯合物均具有清除超氧陰離子自由基的能力，且清除率隨濃度增加而增大，具有濃度依賴性。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，螯合物清除超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)于同濃度AE配體。

圖6 AE及AE-Al螯合物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力（,n=3）

2.3.3 對(duì)羥自由基的清除作用 采用水楊酸法進(jìn)行測(cè)定。取不同質(zhì)量濃度的AE 及AE?Al螯合物的無(wú)水甲醇（2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L-1）1 mL，加入6 mmol·L-1FeSO4溶液、6 mmol·L-1水楊酸溶液、6 mmol·L-1H2O2溶液各1 mL，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，于510 nm 處測(cè)定A[33]，以蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)定A，以蒸餾水代替樣品測(cè)定A。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，按公式（1）計(jì)算羥自由基的清除率。

結(jié)果如圖7 所示，AE 及AE?Al 螯合物均具有清除羥基自由基的能力，且清除率較高，清除率隨濃度變化不大。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，螯合物清除羥基自由基的能力強(qiáng)于AE配體。

圖7 AE及AE-Al螯合物對(duì)羥基自由基的清除能力（,n=3）

3 討論

本研究在甲醇體系下，以AE 為配體，Al3+為形成體，首次合成了AE?Al 螯合物，應(yīng)用紫外?可見分光光譜、紅外光譜、1H?NMR、13C?NMR 及Job 法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并考察螯合物的抗氧化活性。結(jié)果表明，AE通過C?8位羥基氧和C?9位羰基氧與Al3+螯合配位，配位比為2∶1，且在本實(shí)驗(yàn)條件下，螯合物清除DPPH 自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力均強(qiáng)于AE 配體，初步證實(shí)了AE 與Al3+產(chǎn)生了協(xié)同抗氧化作用。本研究結(jié)果一方面證實(shí)了AE?Al 螯合物的可存在性，且由于螯合物易代謝出體外從而認(rèn)為可以降低Al3+的毒性以抑制自由基的產(chǎn)生，另一方面新形成的螯合物也具有一定清除自由基的能力，進(jìn)而驗(yàn)證了前文所提出的假設(shè)，為“配體類中藥”治療氧化應(yīng)激性疾病提供了研究思路。

值得一提的是，研究組在阿爾茨海默病與金屬離子關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)異常代謝的Al3+等金屬離子與阿爾茨海默病多種發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，如Al3+可促進(jìn)β?淀粉樣蛋白（β?amyloid protein，Aβ）的生成與聚集、Tau蛋白聚集與異常磷酸化、自由基損傷等。阿爾茨海默病屬中醫(yī)“癡呆”“絡(luò)病”范疇。“毒損腦絡(luò)”病機(jī)假說是現(xiàn)代中醫(yī)對(duì)癡呆病因病機(jī)的解釋，認(rèn)為“內(nèi)生毒邪”是臟腑功能和氣血運(yùn)行失常使體內(nèi)的生理或病理產(chǎn)物因不能及時(shí)排出，蘊(yùn)積過多而生成[34]。因此，基于對(duì)中醫(yī)“毒損腦絡(luò)”理論及阿爾茨海默病病機(jī)的認(rèn)識(shí)，研究組將過量的自由基、異常磷酸化的Tau 蛋白及Aβ，歸為“內(nèi)生毒邪”范疇，而異常代謝的Al3+等金屬離子是誘導(dǎo)“內(nèi)生毒邪”產(chǎn)生的“外邪”，進(jìn)而提出了“配體類中藥”——大黃蒽醌類單體治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制假說：一方面大黃蒽醌類單體通過配位“金屬離子外邪”以消除“內(nèi)生毒邪”，另一方面大黃蒽醌單體與“金屬離子外邪”形成的配合物也可以除去自由基這種“內(nèi)生毒邪”[35]。本研究結(jié)果證實(shí)了AE?Al 螯合物的可存在性及清除自由基的能力，在一定程度上驗(yàn)證了此假說，為研發(fā)其他“配體類中藥”提供借鑒。