喬令瑜，程娟

干眼（dry eye）是眼科常見疾病，以眼部干澀、異物感、畏光等為主要表現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)干眼發(fā)病率達(dá)到21%～30%[1]。按發(fā)病因素，干眼可分為全身因素性、局部因素性、環(huán)境因素性等[2]。西醫(yī)治療主要有淚液替代、抗炎等，而腺體移植術(shù)則適用于重度干眼，但有產(chǎn)生并發(fā)癥（腺體壞死、積液等）的可能[3]。因此，尋找可針對(duì)性治療干眼的藥物成為研究熱門。

中醫(yī)學(xué)上干眼屬于“白澀癥”范疇，治療有中藥、針灸、離子導(dǎo)入等方法，因療效確切、副作用小而受到廣泛應(yīng)用。鬼針草首載于《本草拾遺》[4]，可降血壓，抑菌抗炎[5]。上世紀(jì)90 年代有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鬼針草可致人流淚，研究證實(shí)鬼針草口服及其提取液滴眼對(duì)干眼有效[6-7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為鬼針草具有類雄激素作用，對(duì)雄激素缺乏型及淚液分泌不足型干眼均具有良好效果[8-9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)囊括生物信息學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)等，可對(duì)藥物及疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整體預(yù)測(cè)，將兩者的相互作用關(guān)系可視化并進(jìn)行闡釋。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，揭示鬼針草治療干眼的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 鬼針草活性成分與作用靶點(diǎn)的篩選與收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)TCMSP，在“Herb name”詞條框中輸入“鬼針草”，獲取分子信息，以“口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%”“藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18”作為篩選條件獲取鬼針草的活性化學(xué)成分。并使用Uniprot對(duì)活性成分作用的靶蛋白名，以“organism：homo sapiens”和“reviewed：yes”為篩選條件將靶蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.2 干眼潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及關(guān)鍵基因獲取

通過OMIM、DrugBank、TTD、Genecards 數(shù)據(jù)庫，其中Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選條件為相關(guān)性分?jǐn)?shù)（Relevance score）≥1.855。以“dry eye”為關(guān)鍵詞檢索干眼相關(guān)基因，刪除重復(fù)值后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理合并。通過Venny 工具將鬼針草相關(guān)靶點(diǎn)與干眼相關(guān)靶點(diǎn)取交集并繪制Venny 圖，交集基因?yàn)殛P(guān)鍵基因。

1.3 關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因獲取

將關(guān)鍵基因?qū)隨TRING 在線數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，以可靠性閾值＞0.4 作為截?cái)嘀?，將?shù)據(jù)下載后導(dǎo)出為“TSV”及“png”格式。隨后“TSV”格式數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 可視化分析軟件進(jìn)行可視化，去除游離節(jié)點(diǎn)，使用CentiScape 中“度中心性”算法計(jì)算degree 值評(píng)估網(wǎng)絡(luò)中基因節(jié)點(diǎn)的重要性，篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)，選取degree 值前10 位的基因作為核心基因并進(jìn)行可視化。

1.4 關(guān)鍵基因富集分析

基因本體學(xué)（gene ontology，GO）可對(duì)高通量基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因開展生物學(xué)進(jìn)程（biological processes，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）分析，Kyoto基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對(duì)基因進(jìn)行功能分析及預(yù)測(cè)。使用R 語言中clusterProfiler 包對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)GO和KEGG 分析和可視化，其中GO 分析的篩選條件為P＜0.01，Q＜0.05；KEGG 分析的篩選條件為P＜0.05。

1.5 鬼針草-干眼-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)GO 功能富集分析結(jié)果，預(yù)測(cè)治療干眼的主要靶點(diǎn)，并使用Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建“鬼針草-干眼-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 鬼針草活性成分

通過TCMSP 檢索到47 個(gè)鬼針草化合物，篩選出6 個(gè)活性化合物。將鬼針草對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行基因注釋，刪除重復(fù)值，得到218 個(gè)靶點(diǎn)（表1）。

表1 鬼針草活性化合物基本信息

2.2 干眼相關(guān)靶點(diǎn)及關(guān)鍵基因獲取

從OMIM、DrugBank、TTD、Genecards 數(shù)據(jù)庫中分別獲取到160、27、3、1,145 條疾病相關(guān)靶點(diǎn)，取并去重后得到1,313 條干眼相關(guān)基因靶點(diǎn)信息。將鬼針草相關(guān)靶點(diǎn)與干眼相關(guān)靶點(diǎn)取交集共得到123 個(gè)交集基因?yàn)楣磲槻葜委煾裳鄣年P(guān)鍵基因（圖1）。

圖1 鬼針草和干眼相關(guān)靶點(diǎn)匹配

2.3 關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因獲取

PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建共得到123 個(gè)蛋白，2,228 條相互關(guān)系，平均點(diǎn)度36.2（圖2A），依據(jù)Degree 算法得到排名前10 的核心基因?yàn)椋篈KT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、EGF、EGFR、PTGS2（圖2B）。

圖2 鬼針草與干眼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與核心基因。2A 鬼針草治療干眼關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；2B 鬼針草治療干眼核心基因

2.4 關(guān)鍵基因富集分析

關(guān)鍵基因GO 富集共870 條，其中BP 787 條，CC 25 條，MF 57 條，主要與調(diào)控細(xì)胞炎癥因子、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)、衰老等有關(guān)（圖3）；KEGG 通路共富集241 條，主要與Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號(hào)通路，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路等有關(guān)（圖4）。

圖3 鬼針草與干眼GO 富集分析。紅色代表生物過程，綠色代表細(xì)胞成分，藍(lán)色代表分子功能

圖4 鬼針草與干眼KEGG 富集分析。條形圖顏色表示校正后P 值大小

2.5 鬼針草-干眼-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建鬼針草-干眼-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，使用內(nèi)置Network Analyzer 程序?qū)磲槻葜委煾裳劬W(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得鬼針草核心成分及作用靶點(diǎn)（圖5）。

圖5 鬼針草-干眼-通路網(wǎng)絡(luò)。青色為生物學(xué)進(jìn)程，黃色為鬼針草成分，紅色為疾病，藍(lán)色為靶點(diǎn)名稱

3 討論

2020 年中國(guó)干眼專家共識(shí)[2]認(rèn)為，干眼為多因素引起的眼表疾病，眼表微環(huán)境紊亂是其主要的病理生理學(xué)改變，而眼表微環(huán)境由多種因素共同參與維持平衡，炎癥、免疫等原因均可造成眼表微環(huán)境紊亂，導(dǎo)致干眼發(fā)生。隨著相關(guān)炎癥機(jī)制研究不斷深入，干眼的抗炎治療亦成為研究熱點(diǎn)。

本研究通過對(duì)鬼針草活性成分的作用靶點(diǎn)及干眼相關(guān)靶點(diǎn)取交集，篩選出鬼針草治療干眼的活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行生物過程和信號(hào)通路分析。研究表明，鬼針草治療干眼的關(guān)鍵成分為黃酮類化合物、檞皮素、木犀草素等。STRING 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析提示，核心基因包括表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等。黃鶴齡等[10]研究顯示，TNF-α、IL-6 在蒸發(fā)過強(qiáng)型干眼中特異性升高，認(rèn)為TNF-α、IL-6 可作為干眼診斷和療效指標(biāo)。崔紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、TNF-α 及VEGF 等炎癥因子濃度均高于正常對(duì)照組，認(rèn)為TNF-α 等炎癥因子可促使VEGF 表達(dá)上調(diào)，其作用機(jī)制可能是炎癥因子激活眼表炎癥反應(yīng)并持續(xù)對(duì)眼表產(chǎn)生損害。另外，EGF 可促進(jìn)結(jié)膜杯狀細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)也是淚液中免疫成分之一[12]。GO 功能富集分析顯示，鬼針草主要通過調(diào)控細(xì)胞炎癥因子、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程治療干眼。KEGG 通路富集分析提示，靶點(diǎn)多富集于TLRs 信號(hào)通路，NF-κB 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路。TLRs 存在于所有生物體的大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是一類新型模式識(shí)別受體，在免疫反應(yīng)中起重要作用[13]。目前，已有研究證實(shí)TLR2、TLR4、TLR9 等在干眼患者外周血中的表達(dá)顯著增加[14-15]，其表達(dá)量同干眼角膜炎癥程度呈正相關(guān)[16-17]。由此可見，TLR 信號(hào)通路參與了干眼的發(fā)生發(fā)展，其激活水平與炎癥因子、TNF-α 水平及淚液滲透壓升高等均具有密切聯(lián)系。NF-κB 存在于真核細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞并導(dǎo)致相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫、炎癥和細(xì)胞凋亡等方面具有獨(dú)特作用，多種因素如白細(xì)胞介素-1（interleukin-6，IL-1）、TNF-α 等可以激活NF-κB 啟動(dòng)免疫反應(yīng)和細(xì)胞分化等過程[18]。研究顯示[19]，角膜上皮細(xì)胞中NF-κB 通路可由高滲淚液激活，導(dǎo)致炎性因子在眼表高表達(dá)。MAPK 信號(hào)通路是廣泛存在并高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)、細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)反應(yīng)中發(fā)揮作用[20]。LUO 等[21]的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠干眼可激活MAPK 信號(hào)通路，并刺激眼表炎性因子產(chǎn)生，提示MAPK 信號(hào)通路在干眼發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。結(jié)合KEGG 通路富集分析，本研究認(rèn)為鬼針草可能通過TLR 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路減輕眼表炎癥反應(yīng)，有助于改善干眼。然而，KEGG 通路富集分析結(jié)果除TLR 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路外，尚有白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路等，提示鬼針草可能通過多種機(jī)制對(duì)干眼的眼表微環(huán)境進(jìn)行調(diào)控。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)鬼針草治療干眼作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明，鬼針草可通過對(duì)EGF、TNF、VEGFA、IL-6 等基因的影響，以及對(duì)TLR、NF-κB、MAPK 信號(hào)通路的調(diào)控，達(dá)到減輕干眼患者眼表炎癥反應(yīng)，改善干眼主觀癥狀及臨床指標(biāo)的效果。本研究可為干眼的藥物選擇及治療方案提供新思路。