巫燕慧，林海丹，陳英男，張 忠△，黃若蘭

1 深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院/南方科技大學(xué)鹽田醫(yī)院，深圳 518000；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳市中醫(yī)院；3 深圳大學(xué)總醫(yī)院

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。╝therosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）是全球范圍內(nèi)人類死亡的主要原因，世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年心血管疾病將成為全世界第一死因［1］。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是ASCVD 最基本的病理改變，是由大量脂質(zhì)沉積在動(dòng)脈管壁形成脂肪條紋而后逐漸發(fā)展成粥樣斑塊并引發(fā)多種并發(fā)癥的慢性動(dòng)脈疾?。?］。研究認(rèn)為AS既是一種慢性炎癥性疾病，又是一種脂質(zhì)代謝紊亂造成的疾病［3］。細(xì)胞脂質(zhì)代謝中膽固醇的代謝失衡可促進(jìn)AS 的發(fā)生及進(jìn)展［4］，而血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的凋亡則導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（覆蓋斑塊的纖維帽的主要成分）分泌減少，使斑塊纖維帽變薄、降解，加劇斑塊不穩(wěn)定，甚至發(fā)生破裂［5-6］，從而導(dǎo)致發(fā)生不良心血管事件（cardiovascular events，CVE）。

溫腎化痰方由廣東省名中醫(yī)羅陸一教授在二仙湯基礎(chǔ)上化裁而成，由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香組成。前期研究發(fā)現(xiàn)該方具有降低小鼠低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，下調(diào)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Orail、Caspase 3、Caspase 9、Bax 基因及蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2基因及蛋白表達(dá)作用［7］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同濃度溫腎化痰方對(duì)氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量的影響，為溫腎化痰方防治AS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只6 周齡健康雄性Wistar 大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（250±10）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心三水基地（批號(hào)：44411600003988），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（粵）2014-0035。本實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。飼養(yǎng)條件為每日光照12 h、黑暗12 h，循環(huán)進(jìn)行，飲食、飲水不受限制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑與儀器平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基（smooth muscle cell medium，SMCM）培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco，批號(hào)：1427263）；胎牛血清（美國(guó)Gibco，批號(hào)：1414426）；二甲基亞砜DMSO（德國(guó)默克SIGMA-ALDRICH，批號(hào)：Lot SHBB3758V）；Formazan溶解液DMSO（北京索萊寶M1020，批號(hào)：Lot NO20180312 SHBB3758V）；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Beyotime C1062M，批號(hào)：111117180621）；總膽固醇檢測(cè)試劑盒（南京建成A111-1）；游離膽固醇檢測(cè)試劑盒（上海索萊寶BC1895）；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo HERAcell 150i）；倒置生物顯微鏡（OPTEC BDS200-PH）；解剖鏡（廣州明美光電技術(shù)有限公司）；熒光顯微鏡（廣州明美光電技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan Mk3）；TDL-80-2B 型低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠飛鴿）；WD-9405B 型水平搖床（北京六一生物科技有限公司）；SW-CJ-1FD型無(wú)菌超凈臺(tái)（蘇潔凈化）；96孔板（美國(guó)Corning）；中藥煎煮機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備廠YFY2020000mL）；LABOROTA4000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph 公司）；K2800 型微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技有限公司）。

1.3 含藥血清制備

1.3.1 中藥制備 溫腎化痰方藥物組成：仙茅10 g，淫羊藿10 g，石菖蒲15 g，瓜蔞皮15 g，乳香15 g（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供）。制備：煎藥前先將飲片制成粗粉，按比例取以上藥物加8 倍量水浸泡30 min，加熱煮沸后再煎煮30 min 取汁；第二煎加5 倍量水直接加熱，煮沸后煎煮30 min 取汁：合并2 次藥液，以4 層棉紗布過(guò)濾。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（蒸發(fā)溫度≤60℃）濃縮成含生藥0.5265 g/mL 的藥液，常溫冷卻后，置于4℃冰箱內(nèi)保存使用。

1.3.2 取血清時(shí)間篩選 以中劑量溫腎化痰方提取液（10.053 g/kg，相當(dāng)于70 kg 成人等效劑量2 倍［8］）灌胃給藥，灌胃容量為每次0.5 mL，每日2次，連續(xù)5天。第5天灌胃結(jié)束后0.5、1、2、3、4 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取2 只大鼠麻醉并固定，腹主動(dòng)脈取血，4℃，離心半徑13.5 cm，13000 r/min 離心10 min，分離出上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后用高效液相色譜法測(cè)定溫腎化痰方有效成分揮發(fā)油類、三萜類、黃酮類含量，比較不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果差異，篩選出溫腎化痰方含藥血清的最佳取材時(shí)間為3 h。

1.3.3 含藥血清制備及分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將32 只Wistar 大鼠分為空白組及低、中、高劑量中藥組，每組8 只。低、中、高劑量中藥組分別按照5.256、10.053、20.106 g/（kg·d）溫腎化痰方提取液（給藥量相當(dāng)于70 kg 成人等效劑量1、2、4倍［8］）灌胃給藥，每次0.5 mL，每日2 次，空白組灌胃等劑量生理鹽水，連續(xù)5天。第5天灌胃結(jié)束3 h后麻醉大鼠并固定，腹主動(dòng)脈取血，分離上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離 處死Wistar大鼠，分離、沖洗、裁剪備用。將小組織塊種于25 cm2培養(yǎng)瓶底，加入SMCM 培養(yǎng)基（含雙抗、FBS、平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物）1 mL，置于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約3～5 h，當(dāng)組織塊自然黏附于瓶壁后把培養(yǎng)瓶放平，使組織塊完全浸入到培養(yǎng)液中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔3 天更換培養(yǎng)基，組織塊周圍的細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)（16～20天）即可傳代。吸去舊培養(yǎng)基，0.01 mol/L PBS 清洗，加入2.5 g/L 胰蛋白酶消化液，室溫下消化約2 min，加入SMCM 培養(yǎng)基終止消化，離心、去上清、重懸細(xì)胞，處理后置光學(xué)顯微鏡下觀察：藍(lán)色細(xì)胞為異?；蛩劳黾?xì)胞，活細(xì)胞不著色，并行計(jì)數(shù)后傳代培養(yǎng)，每隔2 天換液1 次，待細(xì)胞融合成致密單層后可再次傳代。取培養(yǎng)的P2 代細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于內(nèi)置有蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)，24 h 后待細(xì)胞自然貼壁、生長(zhǎng)良好時(shí)，取出蓋玻片，沖洗、孵化，復(fù)染核10 min，在熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞鑒定。將鑒定合格的血管平滑肌細(xì)胞接種到6 孔培養(yǎng)板中，置5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)2 h 后去上清液，洗去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3天后隨機(jī)分組。

1.4.2 分組 分離的主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞繼續(xù)在6 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)第3 天后分為：1）正常組：10%Gibco 血 清；2）對(duì) 照 組：ox-LDL 70 mg/L［9］+10%Gibco 血清；3）低劑量中藥組：ox-LDL 70 mg/L+低劑量中藥含藥血清；4）中劑量中藥組：ox-LDL 70mg/L+中劑量中藥含藥血清；5）高劑量中藥組：ox-LDL 70 mg/L+高劑量中藥含藥血清。所有分組加入血清后均作用于細(xì)胞12 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率 細(xì)胞培養(yǎng)第3 天，藥物處理后96 孔板每孔加入10 μL MTT 溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan 溶解液，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formanzan 全部溶解。37℃孵育4 h左右，紫色結(jié)晶全部溶解。用酶標(biāo)儀在492 nm 處測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次每組設(shè)4～5 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞存活率（%）=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.5.2 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平 1）將貼壁細(xì)胞用0.25%的胰酶消化，于室溫離心半徑13.5 cm，2000 r/min離心5～10 min，收集細(xì)胞，用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，用預(yù)冷1×PBS（4℃）重懸細(xì)胞1次，離心半徑13.5cm，2000 r/min 離心5～10 min，洗 滌 細(xì)胞；2）加入300 μL的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC 混勻后避光，室溫孵育15 min進(jìn)行標(biāo)記；3）上機(jī)前5 min再加入5 μL PI染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex 為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em 為530 nm，Annexin V 綠色熒光通過(guò)FITC 通道（FL1）檢測(cè)，PI 紅色熒光通過(guò)PI通道（FL2或FL3）檢測(cè)，進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門(mén)的位置；4）以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，以Annexin V FITC 為橫軸，PI 為縱軸，將細(xì)胞分為4 個(gè)區(qū)，1 區(qū)：機(jī)械損傷細(xì)胞（Annexin V FITC-/PI+）；2區(qū)：凋亡晚期或壞死細(xì)胞（Annexin V FITC+/PI+）；3區(qū)：存活細(xì)胞（Annexin V FITC-/PI-）；4 區(qū)：早期凋亡細(xì)胞（Annexin V FITC+/PI-）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯水平 收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，重懸于0.5 mL 磷酸鈉緩沖液（pH 7.4，0.1 mol/L）中，超聲波裂解細(xì)胞取上清液，微量分光光度計(jì)檢測(cè)TC 和游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）濃度。以考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定各組細(xì)胞樣品中蛋白質(zhì)含量，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量用每毫克蛋白所含膽固醇含量表示，反應(yīng)液中省去膽固醇酯酶用以檢測(cè)游離膽固醇。細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）=TC-FC。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率與正常組比較，對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率下降（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，低、中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率增加（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率增加（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組細(xì)胞主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率增加（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率比較（±s） %

表1 各組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞存活率比較（±s） %

注：*表示與正常組比較，P＜0.01；△表示與對(duì)照組比較，P＜0.01；▲表示與低劑量中藥組比較，P＜0.01；○表示與中劑量中藥組比較，P＜0.01

組別正常組對(duì)照組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組第1次實(shí)驗(yàn)107.45±0.55 44.87±0.38 60.27±0.43 84.33±0.44 91.79±0.44第2次實(shí)驗(yàn)108.05±0.51 45.04±0.46 60.70±0.50 83.88±0.34 92.49±0.51第3次實(shí)驗(yàn)108.45±0.51 45.63±0.44 61.08±0.29 85.39±0.43 93.33±0.53平均值107.98±0.69 45.18±0.56*60.68±0.55△84.53±0.78△▲92.54±0.83△▲○

2.2 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平正常組、對(duì)照組及低、中、高劑量中藥組主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡率分別為（5.42±0.05）%、（39.51±0.44）%、（29.67±0.18）%、（20.44±0.50）%、（8.01±0.20）%。與正常組比較，對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，低、中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平均下降（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平下降（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡水平下降（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡率比較

2.3 主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯與正常組比較，對(duì)照組TC 及CE 水平升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，低、中、高劑量中藥組細(xì)胞內(nèi)TC及CE水平降低（P＜0.01）。與低劑量中藥組比較，中、高劑量中藥組細(xì)胞內(nèi)TC 及CE 水平降低（P＜0.01）。與中劑量中藥組比較，高劑量中藥組細(xì)胞內(nèi)TC 及CE水平降低（P＜0.01）。各給藥組FC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯比較（±s）

表2 各組大鼠細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯比較（±s）

注：*表示與正常組比較，P＜0.01；△表示與對(duì)照組比較，P＜0.01；▲表示與低劑量中藥組比較，P＜0.01；○表示與中劑量中藥組比較，P＜0.01

組別正常組對(duì)照組低劑量中藥組中劑量中藥組高劑量中藥組TC（mmol/L）0.25±0.02 0.89±0.04*0.68±0.08△0.51±0.07△▲0.40±0.07△▲○FC（μmol/L）56.32±0.38 60.83±0.26 59.32±0.14 58.35±0.34 57.49±0.23 CE（mg/L）22.05±2.13 107.87±5.82*75.75±10.07△51.89±7.69△▲42.51±9.03△▲○

3 討論

中醫(yī)學(xué)無(wú)ASCVD 病名，根據(jù)其癥狀屬“胸痹”“心痛”范疇。《素問(wèn)·五藏生成篇》載：“心之合脈也，其榮色也，其主腎也”，腎陽(yáng)為一身陽(yáng)氣之根本，心陽(yáng)依賴于腎陽(yáng)之溫煦。因腎陽(yáng)虛衰，氣化失職，致水液輸布運(yùn)化失常，聚濕成痰，痰阻心胸；腎陽(yáng)虛損，無(wú)力溫煦心陽(yáng)，使心氣推動(dòng)血液運(yùn)行無(wú)力，血脈運(yùn)行緩慢，瘀阻于心脈［10］。中醫(yī)藥治療AS 療效較好，涉及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、穩(wěn)定斑塊等機(jī)制［11-12］。

溫腎化痰方由仙茅、淫羊藿、石菖蒲、瓜蔞皮、乳香組成。方中仙茅、淫羊藿為君藥，仙茅溫陽(yáng)補(bǔ)腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)脈；淫羊藿性辛、甘、溫，歸肝、腎經(jīng)；石菖蒲辛溫，開(kāi)竅豁痰，配合瓜蔞皮寬胸理氣開(kāi)痰結(jié)，消痰散結(jié)以治其標(biāo)；乳香性溫，味辛善行，能行血分瘀滯，開(kāi)經(jīng)絡(luò)壅滯，并載諸藥直達(dá)病所，為引經(jīng)佐使藥。全方溫補(bǔ)、消痰并用，以溫腎助陽(yáng)為主，活血化痰為輔。對(duì)胸痹心腎陽(yáng)虛患者單純使用活血化瘀藥療效不足，而以溫腎為本、化痰散瘀藥為輔的溫腎化痰方，方中有補(bǔ)有瀉，用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病，有一定依據(jù)［7，13］。

AS 是以血管內(nèi)皮損傷和血管平滑肌細(xì)胞移行增殖為基礎(chǔ)的病變，其中血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)AS 的發(fā)生、發(fā)展起重要作用［14］。正常生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡維持相對(duì)平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激等條件下，沉積于大中動(dòng)脈內(nèi)膜下的LDL 容易發(fā)生氧化修飾，形成ox-LDL［15］，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)血栓形成，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，促進(jìn)AS斑塊的不穩(wěn)定性［16-17］，也可促進(jìn)LOX-1 的表達(dá)，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，加重斑塊不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致斑塊破裂［18］。溫腎化痰方可減少血管平滑肌細(xì)胞凋亡，保持其穩(wěn)定的存活率，進(jìn)而使血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡維持在平衡狀態(tài)，延緩AS的進(jìn)展。

高脂血癥是AS 發(fā)病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［19］。早期血液中單核細(xì)胞在血管平滑肌細(xì)胞功能受損時(shí)遷移至內(nèi)皮，分化成巨噬細(xì)胞，攝入大量脂質(zhì)，各種因素作用下大量膽固醇酯聚積至細(xì)胞轉(zhuǎn)化成泡沫細(xì)胞，而泡沫細(xì)胞是AS 斑塊形成脂質(zhì)條紋的特征性標(biāo)志，泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂滴存在的主要脂質(zhì)是膽固醇，故膽固醇代謝平衡在AS 發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［20］。溫腎化痰方可降低主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)總膽固醇及膽固醇酯含量，減少細(xì)胞泡沫化，從而延緩AS 進(jìn)程，且在一定劑量范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，其作用效果也增加。

本研究用中藥血清藥理學(xué)方法，證明溫腎化痰方可有效減少ox-LDL 誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞凋亡，有效抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞，減輕主動(dòng)脈血管重構(gòu)，同時(shí)減少細(xì)胞內(nèi)總膽固醇及膽固醇酯含量，減少泡沫細(xì)胞形成，從而延緩AS 發(fā)生發(fā)展。課題組未來(lái)將通過(guò)檢測(cè)相關(guān)炎性因子及mRNA 表達(dá)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。