李興程，張金慧，陳 蓓

鄭州大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉醫(yī)院耳科 鄭州 450052

先天性耳聾是最常見的由遺傳因素導致的疾病，嚴重影響患兒的生長發(fā)育，是我國產(chǎn)前篩查和遺傳預防的重要內(nèi)容[1]。聽性腦干反應(auditory brainstem response，ABR)是檢測聲刺激誘發(fā)的腦干生物電反應，用以評估客觀聽力及判斷病變部位。聽力檢查目前仍然是診斷耳聾的主要依據(jù)，包括短聲誘發(fā)ABR(Click-ABR)、分頻ABR(Chirp-ABR)、多頻聽覺穩(wěn)態(tài)反應(auditory steady-state response，ASSR)和純音聽閾(pure tone auditory，PTA)等。CE-Chirp是一種專門針對行波延遲設計的刺激聲，該聲音按低頻聲-中頻聲-高頻聲順序傳導至耳蝸后，整個基底膜同時震動，使更多神經(jīng)纖維同步放電。研究[2]表明:Chirp音可增大反應幅值，較好反映聽力異常兒童的客觀聽閥，提高低頻聽力預測準確性。但也有研究[3]提出聽力篩查具有較多局限性，易遺漏輕度聽力損失、遲發(fā)性/漸進性耳聾與敏感性耳聾。國內(nèi)外多項大宗流行病學調(diào)查[4-5]結(jié)果顯示，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是先天性耳聾主要的基因變異類型。通過檢測外周血微量全基因組DNA序列能夠快速、高效、精準判斷SNP。本研究對先天性耳聾兒童進行了Chirp-ABR和多位點基因篩查，分析不同基因突變類型患兒聽力是否存在差異，為進一步采取合理聽力干預措施提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2019年5月至2021年5月我院確診的先天性耳聾患兒116例。納入標準：年齡3～10歲，能夠順利完成各項聽力測試，聽閾數(shù)據(jù)可分析?；純罕O(jiān)護人均知情同意。排除復雜性耳聾、耳外傷者，耳內(nèi)感染性疾病(如中耳炎)者，先天耳部結(jié)構或者神經(jīng)發(fā)育異常者。其中男52例，女64例。

1.2 聽力檢查首先采用電耳鏡檢查外耳道、鼓膜，去除外耳道耵聹。掩蔽測試選用窄帶噪聲，使用“平臺法”，分別進行掩蔽后進行Chirp-ABR和ASSR測試。Chirp-ABR測試在標準電磁屏蔽室內(nèi)進行，本底噪聲≤35 dB NHL；測試前采用右美托咪定(2 μg/kg)滴鼻麻醉，患兒進入穩(wěn)定睡眠后開始檢測。采用俄羅斯Neuro-Audio聽覺誘發(fā)電位儀，前額發(fā)際放置記錄電極，鼻根部放置地電線，兩側(cè)乳突部放置參考電極，保證極間電阻≤3 kΩ；采用ER-3A插入式耳機給聲，刺激聲為Chirp聲，刺激類型為交替波，速率為21.1次/s，疊加次數(shù)1 024次，記錄時間窗20 ms，帶通濾波100～3 000 Hz，刺激強度從45 dB NHL開始，每10 dB增減,每個強度至少重復3次；以可重復記錄波V的最小聲強為波V閾值。Chirp-ABR 波V閾值≤30 dB NHL為正常(0 dB NHL=28.7 dB SPL)。ASSR測試準備和電極安放同Chirp-ABR，骨振器放置耳乳突處，氣導較好耳使用ER-3A 插入式耳機進行掩蔽，掩蔽聲為白噪聲，強度為骨導給聲強度上加 30 dB SPL，骨導 ASSR測試載頻為 0.5、1.0、2.0和4.0 kHz，調(diào)制頻率為 77、85、93和101 Hz。系統(tǒng)自動判定各頻率閾值。

1.3 耳聾基因突變檢測抽取外周靜脈血2～3 mL，采用博奧生物集團有限公司的基因組DNA提取和檢測試劑盒，應用微陣列芯片法檢測4個常見耳聾基因的9個SNP位點，包括GJB2 (35delG、176del16、235delC和299delAT)、GJB3(C538C>T)、SLC26A4(2168A>G和IVS7-2A>G)和線粒體 12S rRNA(1494C>T和1555A>G)。按照說明書操作，依次完成PCR擴增、芯片雜交和結(jié)果判讀。

1.4 聽力受損程度評判標準Chirp-ABR：波V閾值≤30 dB NHL為正常聽力，31～50 dB NHL為聽力輕度損失，51～70 dB NHL為中度損失，≥71 dB NHL為重度損失。ASSR：≤35 dB NHL為聽力正常，36～50 dB NHL為輕度損失，51～70 dB NHL為中度損失，≥71 dB NHL為重度損失。兩種檢查均滿足時為聽力某種程度損傷。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析。有和無基因突變組間性別的比較采用χ2檢驗，聽力受損程度的比較采用精確概率法，年齡、Chirp-ABR和ASSR反應閾的比較采用秩和檢驗；采用Spearman相關分析Chirp-ABR和ASSR反應閾的相關性。單位點突變與雙位點突變組、4個單位點突變組間性別、聽力受損程度的比較采用χ2檢驗，年齡、Chirp-ABR和ASSR反應閾的比較采用成組設計資料的t檢驗或單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 耳聾基因突變情況116例患兒中共73例(62.9%)檢測到耳聾基因突變，其中GJB2基因突變21例(8例35delG、7例176del16、4例235delC、2例299delAT)，GJB3突變6例，SLC26A4突變20例(11例2168A>G，9例IVS7-2A>G)，線粒體12S rRNA突變15例(10例1494C>T和5例1555A>G)，GJB2+SLC26A4雙突變7例，GJB3+線粒體12S rRNA雙突變4例。

2.2 基因突變組與無基因突變組聽力情況的比較見表1?；蛲蛔兘M聽力受損程度重，在0.5、1.0、2.0和4.0 kHz測試頻率下Chirp-ABR和ASSR反應閾均高于無基因突變組。Chirp-ABR和ASSR反應閾相關性分析結(jié)果見表2，無基因突變組測試頻率在4.0 kHz以下時，Chirp-ABR和ASSR反應閾有較好的相關性；基因突變組各測試頻率下Chirp-ABR和ASSR反應閾均有較好的相關性。

2.3 單位點突變與雙位點突變組聽力情況的比較兩組性別、年齡、聽力受損程度、Chirp-ABR和ASSR反應閾比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4 4個單位點突變組聽力情況的比較4組性別、年齡、聽力受損程度、Chirp-ABR和ASSR反應閾差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表1 基因突變組與無基因突變組聽力情況比較

表2 不同測試頻率下Chirp-ABR和ASSR反應閾的Spearman相關系數(shù)(P)

表3 單位點突變與雙位點突變組聽力情況比較

表4 4個單位點突變組聽力情況比較

3 討論

基因?qū)W篩查和多種聽力檢查是先天性耳聾的必查項目。Chirp-ABR作為目前國際上最新、最先進的ABR設備，在準確性、實用性上優(yōu)于Click-ABR[2]。樓高忠等[6]指出，骨導Chirp-ABR和ASSR能夠反映分頻客觀聽力水平，彌補患者無法配合主觀聽力測試或主觀聽力結(jié)果不可靠的不足。ASSR頻率特異性較好，對人工耳蝸植入候選者殘余聽力的評估具有重大意義[7-9]。Chirp-ABR與ASSR補充，可充分反映各個頻率下的聽力受損情況[10-11]。

研究[12]顯示，50%～70%先天性耳聾主要由遺傳因素所致。韓躍峰等[13]的研究結(jié)果顯示，江淮地區(qū)128例極重度感音神經(jīng)性聾患兒中，基因突變率為36.72%，其中GJB2基因突變最多見。Wen等[14]2016～2017年對我國多地區(qū)新生兒耳聾基因的篩查結(jié)果顯示，東部地區(qū)新生兒耳聾基因篩查比中西部地區(qū)更廣泛，4個基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA)中9個變體和20個變體的組和檢測被廣泛使用，GJB2和SLC26A4基因突變最常見。GJB2為常染色體隱性遺傳基因，其編碼的Cx26 蛋白可與縫隙連接蛋白組成完整的縫隙連接通道，調(diào)控細胞間鉀離子水平，維持細胞間信號轉(zhuǎn)導[15]。GJB2點突變率較高(全國平均突變率為11.8%)，占所有GJB2基因突變的67.7%[16]。SLC26A4 為常染色體隱性遺傳基因，編碼的Pendrin 蛋白參與多種離子成分的跨膜轉(zhuǎn)運，與大前庭導水管綜合征和內(nèi)耳畸形的發(fā)生關系密切[17]。線粒體 12S rRNA為母系遺傳基因，對氨基糖苷類抗菌藥物有極高的敏感性；該基因突變使蛋白質(zhì)合成中與氨基糖苷類藥物形成結(jié)合位點，影響蛋白質(zhì)的合成[18]。

本研究檢測了116例先天性耳聾患兒4個耳聾基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA)9個常見SNP位點，結(jié)果顯示，耳聾基因突變檢出率高達62.9%，其中GJB2、SLC26A4和線粒體12S rRNA突變檢出率較高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，基因突變組聽力受損程度大于無基因突變組，在0.5、1.0、2.0和4.0 kHZ測試頻率下Chirp-ABR和ASSR反應閾均高于無基因突變組；提示耳聾基因突變的患兒聽力受損更嚴重，單純助聽器助聽補償效果欠佳時，可能需盡早行人工耳蝸植入[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，單位點突變與雙位點突變患兒比較，4個單位點突變患兒比較，性別、年齡、聽力受損程度、各測試頻率下Chirp-ABR和ASSR反應閾差異均無統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果顯示，GJB2突變患兒聽力受損程度有增加的趨勢，SLC26A4突變患兒低頻條件下可有殘余聽力，線粒體12S rRNA突變患兒可有輕度聾，但這些發(fā)現(xiàn)并未表現(xiàn)出統(tǒng)計學意義，可能與樣本量較小有關。本研究中SLC26A4突變患兒就診前已反復多次出現(xiàn)波動性聽力下降，在基層醫(yī)院診治效果不佳后轉(zhuǎn)診至我院，殘余聽力較差；而線粒體12S rRNA突變患兒無法明確是否排除了氨基糖苷類藥物接觸史；其他耳聾基因也并未檢測。

本研究結(jié)果顯示，基因突變組患兒各頻率下Chirp-ABR和ASSR反應閾有較好的相關性。Chirp-ABR可以明確低頻下殘余聽力水平，而ASSR測試的聽力可能和實際聽力存在一定差距，因此對于部分存在低頻殘余聽力的患兒，尤其是SLC26A4基因突變的大前庭水管綜合征患兒，Chirp-ABR檢測具有重要的臨床意義和必要性。

綜上所述，先天性耳聾兒童GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA這4個耳聾基因的突變率較高，以單位點突變?yōu)橹?；有耳聾基因突變的兒童聽力受損程度嚴重，Chirp-ABR可以較準確地反映患兒各頻率客觀聽力。