郎利娟，崔淑君，朱起杰，3，楊 麗，3，王 影，3，姜 北，3，肖朝江，3*

（1.大理大學(xué)藥物研究所，云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），云南大理 671000；4.畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州畢節(jié) 551700）

脂質(zhì)代謝紊亂俗稱血脂異?；蚋咧Y，是指血液中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）或甘油三酯（TG）中的一項(xiàng)或多項(xiàng)過(guò)高，或伴有高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平過(guò)低為特征的一類代謝性疾病。脂質(zhì)代謝紊亂與糖尿病、阿爾茨海默病、肥胖、癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病等多種疾病的病理有關(guān)〔1-2〕。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2016年估計(jì)有1 790萬(wàn)人死于心血管疾病，占全球死亡總數(shù)的31%；非傳染性疾病導(dǎo)致的1 700萬(wàn)70歲以下死亡人群中，37%由心血管疾病造成〔3〕。研究表明，血脂異常能顯著增加心血管疾病的患病率和病死率〔1-2〕。因此，降低血脂可以有效地干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

菊科（Compositae）植物全球約有1 000屬，2.5萬(wàn)～3萬(wàn)種，廣泛分布于世界各地。我國(guó)約有200余屬，2 000多種，遍布全國(guó)各地，種類繁多，且許多種類富有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如萵苣、萵筍、茼蒿、菊芋等為日常食用蔬菜，向日葵、小葵子、蒼耳的種子可榨取食用或工業(yè)用油，橡膠草和銀膠菊可提取橡膠〔4〕。此外，許多菊科植物還具有良好的降脂活性。例如，菊科植物Solidago chilensis醇提物及其主成分槲皮素具有降低膽固醇和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用〔5〕；Launaea taraxacifolia的葉具有顯著的體外降脂活性〔6〕；北艾Artemisia vulgaris具有降血脂、抗炎、抗氧化作用，可作為預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的藥物〔7〕；蓍Achillea millefolium的甲醇提取物和水提物對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠具有顯著的抗高血糖和降血脂活性〔8〕；白蓮蒿Artemisia sacrorum95%乙醇提取物能顯著降低人肝癌細(xì)胞HepG2的脂質(zhì)積累〔9〕；含有紅花Carthamus tinctorius提取物的丹紅注射液能明顯增加肝臟脂肪分解，減少脂肪酸合成〔10〕。

為從植物中發(fā)現(xiàn)高效、低毒副作用的新型降脂藥物，本研究通過(guò)高脂細(xì)胞模型對(duì)采自滇西的33種菊科植物進(jìn)行體外降脂活性篩選，以期能發(fā)現(xiàn)活性較好的藥用植物，為尋找植物來(lái)源的新型降脂天然產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器BSC－1000-Ⅱ-A2生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；5510E CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)NuAire公司）；DT5－6低速臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；M700E倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Coolsafe 95－15冷凍干燥機(jī)（丹麥Labo Gene公司）；AL204電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）；HVE－50高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；DW－86L628－80℃低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；RE－5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 細(xì)胞株和試藥人肝癌細(xì)胞HepG2由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所黎勝紅研究員惠贈(zèng)；Gibco RPMI 1640干粉培養(yǎng)基（批號(hào)：2126369）、Gibco澳洲特級(jí)胎牛血清（FBS，批號(hào)：1414426）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：RNBF6155）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，批號(hào)：513C046）、青霉素－鏈霉素溶液（批號(hào)：20190125）、胰蛋白酶－乙二胺四乙酸消化液（批號(hào)：20190819）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；油酸（OA，批號(hào)：C10375483）、油紅O（批號(hào)：C10096989）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)：EZ6789D116）購(gòu)自德國(guó)Biofroxx公司；棕櫚酸鈉（PA，批號(hào)：C04D10A104981）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；辛伐他?。ㄅ?hào)：WZG110808－039N）購(gòu)自美國(guó)Ark Pharm公司；CCK－8試劑盒（批號(hào)：20200701）購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 植物樣品33種菊科植物樣品均采自滇西地區(qū)，由大理大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張德全教授鑒定，植物標(biāo)本現(xiàn)均存放于大理大學(xué)藥物研究所。植物信息見(jiàn)表1。

表1 33種菊科植物樣品的基本信息

2 方法

2.1 植物提取物的制備33種菊科植物樣品干燥后粉碎，75%乙醇回流提取3次，合并后的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃以下除去乙醇，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥，得相應(yīng)凍干粉，備用。

2.2 細(xì)胞活力檢測(cè)參考文獻(xiàn)〔11〕方法，采用CCK－8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。簡(jiǎn)要步驟如下：HepG2細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，置于37°C、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白組、陰性對(duì)照組、供試組（模型組和給藥組）。空白組無(wú)細(xì)胞，僅含同體積RPMI 1640培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組含細(xì)胞，不加誘導(dǎo)劑和各提取物；模型組含細(xì)胞和誘導(dǎo)劑；給藥組含細(xì)胞、誘導(dǎo)劑和各提取物。誘導(dǎo)劑為經(jīng)40%BSA結(jié)合的0.6 mmol/L OA和0.3 mmol/L PA；各提取物終濃度為0.5 mg/mL。培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組在450 nm處的吸光度（OD）。細(xì)胞活力按以下公式計(jì)算：細(xì)胞活力（%）=［（供試組OD值-空白組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值）］×100%。

2.3 體外降脂活性測(cè)試參考文獻(xiàn)〔12〕方法，進(jìn)行體外降脂活性測(cè)試。簡(jiǎn)要步驟如下：HepG2細(xì)胞以1.5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，置于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，細(xì)胞豐度達(dá)90%以上時(shí)，將舊培養(yǎng)液（含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液）更換為含誘導(dǎo)劑的新鮮培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組換為含有與誘導(dǎo)劑同體積的40%BSA培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，給藥組每孔加入20μL提取物溶液，終濃度為0.5 mg/mL，空白組與模型組每孔加入20μL相應(yīng)溶媒（植物提取物溶媒為滅菌超純水，辛伐他汀溶媒為DMSO）。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次，每孔加入60μL 10%的甲醛溶液。固定30 min，移除固定液，PBS清洗1次，每孔加入60μL 0.4 mg/mL油紅O工作液染色。60 min后，移除染色液，PBS沖洗3次，置倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴染色情況。最后每孔加入200μL異丙醇（分析純），充分溶解后，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處各組的OD值。降脂率按以下公式計(jì)算：降脂率（%）=［1-（給藥組OD值-空白組OD值）/（模型組OD值-空白組OD值）］×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明，在0.5 mg/mL濃度下，除多花百日菊給藥組細(xì)胞幾乎全部死亡外，其余植物提取物均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。體外降脂活性篩選結(jié)果顯示，陽(yáng)性藥物辛伐他汀終濃度為50μmol/L時(shí)，無(wú)細(xì)胞毒性，體外降脂率為（11.4±2.9）%。篩選的27屬33種菊科植物中有19屬24種（占比70%以上）具有不同程度的降脂活性；其中降脂率大于10%的有10屬、12種，約占1/3。在篩選出的具有降脂活性的植物中，熊膽草、紫莖澤蘭降脂活性最好，體外降脂率分別為（18.4±1.9）%、（18.4±9.7）%，其次是狼杷草和腫柄菊，體外降脂率分別為（17.5±10.2）%、（15.1±13.4）%，此4種菊科植物提取物與辛伐他汀體外降脂率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 33種菊科植物體外降脂活性篩選結(jié)果（x±s，n=4）

4 討論

血脂異常是心血管疾病發(fā)生及發(fā)展的主要因素之一。對(duì)于中高風(fēng)險(xiǎn)的高脂血癥患者，可以通過(guò)改變不健康的生活方式和藥物干預(yù)進(jìn)行降脂。目前，傳統(tǒng)的調(diào)血脂藥物主要有他汀類、貝特類、煙酸類、依折麥布、膽汁酸螯合劑等，隨著研究的不斷深入，一些新型調(diào)血脂靶點(diǎn)和降血脂藥物逐漸被發(fā)現(xiàn)。在脂質(zhì)代謝中，除了著名的羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG－CoA）外，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）、載脂蛋白B（ApoB）、載脂蛋白C-Ⅲ（ApoC－Ⅲ）、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（MTP）、ATP檸檬酸裂合酶（ACL）、血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα），以及人血管生成素樣蛋白（ANGPTL）等均扮演著重要角色，但是無(wú)論是傳統(tǒng)調(diào)血脂藥物還是新型降血脂藥物都具有諸多局限性及不良反應(yīng)〔13－14〕，因此，尋找安全、高效的新型降血脂藥物已然成為一項(xiàng)長(zhǎng)期且艱巨的研究。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前已從腫柄菊中分離得到了以倍半萜和黃酮類化合物為主的100多個(gè)化合物，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其葉的水提物具有顯著的大鼠體內(nèi)降血脂活性〔15〕，這與本研究腫柄菊地上部分醇提物具有較好的體外降脂活性結(jié)果一致。研究還表明，腫柄菊的降脂活性物質(zhì)基礎(chǔ)可能并非其主成分，而是皂苷類成分〔15〕。狼杷草主要含黃酮類化合物，其次為聚炔類特征成分〔16〕。根據(jù)現(xiàn)有的研究報(bào)道，黃酮類成分多通過(guò)干擾脂質(zhì)吸收和合成、誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝等發(fā)揮降脂活性〔17〕，因此推測(cè)其可能為狼杷草的降脂物質(zhì)基礎(chǔ)。熊膽草的主要成分為齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，此外還含有黃酮、二萜及其糖苷類等成分〔18〕，降脂成分為皂苷類還是黃酮類化合物，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。紫莖澤蘭主要含暫未見(jiàn)降脂活性報(bào)道的杜松烷型倍半萜類化合物，其次為綠原酸衍生物，以及少量黃酮等其他成分〔19〕，故其降脂活性成分和機(jī)制還有待深入研究。

本研究中體外降脂活性較好的黃花蒿、野艾蒿同屬植物豬毛蒿Artemisia capillaris水提物具有較好的大鼠體內(nèi)降脂活性〔20〕；鬼針草、狼杷草同屬植物Bidens odorata乙醇提取物及其中糖苷類化合物具有較好的小鼠體內(nèi)降脂活性〔21〕；推測(cè)菊科蒿屬和鬼針草屬植物的降脂活性可能較同科其他屬植物強(qiáng)，并在一定程度上具有普遍性。本研究篩選出12種植物具有較好的降脂活性（降脂率大于10%），然而僅腫柄菊有降脂活性報(bào)道，提示這些菊科植物具有較大的后續(xù)深入研究?jī)r(jià)值和潛力。此外，豨薟和云南蒿等植物出現(xiàn)降脂率為負(fù)數(shù)情況，鏡檢發(fā)現(xiàn)，這些植物可能具有一定的促進(jìn)脂質(zhì)堆積或促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，抑或兩種作用同時(shí)存在。