何舒婷，張雨源，黃 會(huì)，肖 婕，楊興美

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2大理大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

由于現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和生活方式的改變，處于亞健康狀態(tài)的人群日益增加，從而導(dǎo)致各類應(yīng)激性疾病的發(fā)生〔1〕。應(yīng)激反應(yīng)是指機(jī)體在接受應(yīng)激原后，為了減緩應(yīng)激原帶來的壓力，機(jī)體的神經(jīng)、免疫、分泌系統(tǒng)表現(xiàn)出生理和心理癥狀的應(yīng)答性反應(yīng)，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。缺氧是應(yīng)激性疾病的一種重要應(yīng)激原。中國(guó)地形復(fù)雜，海拔高低不等，空氣中氧氣的含量也會(huì)隨之發(fā)生改變，人們因?yàn)閷W(xué)習(xí)、生活改變居住地時(shí)就可能出現(xiàn)缺氧而引起氧化應(yīng)激。因此研究應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，尋覓預(yù)防及減緩應(yīng)激性疾病的有效途徑就顯得尤為重要。

西歸是傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹Vicatia thibeticade Boiss的根，在云南大理作為中藥當(dāng)歸的替代品，藥食兩用，又名獨(dú)腳當(dāng)歸〔2〕。多項(xiàng)研究〔3-7〕發(fā)現(xiàn)西歸具有廣泛的藥理活性。西歸含有多糖、氨基酸及黃酮等物質(zhì)〔2〕，其中西歸粗多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、增強(qiáng)抗感染能力等作用〔8〕，且可改善力竭游泳后小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，具有顯著抗疲勞作用〔4〕。本研究主要探討小鼠在缺氧狀態(tài)時(shí)，西歸粗多糖能否有效延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間及提高小鼠的抗氧化應(yīng)激能力，繼而為下一步西歸的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠128只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由昆明市艾尼莫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，合格證號(hào)：SCXK（滇）2016-0002。飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑西歸粗多糖自制；紅景天苷購(gòu)自南京春秋生物科技有限公司，批號(hào)：HJTG20171205；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒、一氧化氮（NO）測(cè)試盒、乙酰膽堿酯酶（AChE）測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20181203，20181203，20181206，20181206，20180714；無水乙醇、冰醋酸均購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20170327，20171027。

1.3 儀器 EL104型梅特勒電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TL-16R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)機(jī)械研究所）；EMP-168G半自動(dòng)化分析儀（深圳市恩普電子技術(shù)有限公司）；HH·E21·Cu600電熱恒溫水溫箱（上海醫(yī)療器械七廠）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

2 方法

2.1 西歸粗多糖的制備 西歸購(gòu)于大理本地，由大理大學(xué)生藥教研室楊月娥高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定。取干燥充分的西歸1 kg，粉碎后按1∶10料液比用85%乙醇在室溫下浸提3次，提取后的西歸進(jìn)行再干燥，充分干燥后按料液比1∶10加入蒸餾水，隨后在85℃下加熱提取3次，1 h/次，4 500 r/min離心20 min，取上清液，60℃減壓濃縮至浸膏。將浸膏放入帶刻度的錐形瓶中量取體積，隨后與10倍體積的95%乙醇混合并攪拌均勻，室溫下靜置48 h，10 000 r/min離心10 min，沉淀用水溶解，濃縮，冷凍干燥后得西歸粗多糖，用苯酚-硫酸法檢測(cè)西歸粗多糖的含量〔8〕。

2.2 小鼠缺氧環(huán)境的制備取一只250 mL的廣口瓶，裝入10 g鈉石灰（成分：CaO 7.5 g，H2O 2.1 g，NaOH 0.3 g，KOH 0.1 g），瓶口取適量凡士林涂抹密封，并檢查氣密性。記錄小鼠存活時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)是從密封瓶蓋開始計(jì)時(shí)，直到小鼠死亡，即為缺氧存活時(shí)間〔9-10〕。

2.3 動(dòng)物分組與給藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分兩批次進(jìn)行：第一批次小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，即：缺氧模型組、紅景天苷組（360 mg/kg）、西歸粗多糖低劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（200 mg/kg）、高劑量組（400 mg/kg）。紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組灌胃相對(duì)應(yīng)的藥物7 d，1次/d，每次0.2 mL/10 g；缺氧模型組灌胃相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液。第二批次小鼠隨機(jī)分成6組，每組13只（兩批小鼠不是同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，故需從第二批小鼠中隨機(jī)抽出3只，并測(cè)定這3只小鼠在缺氧環(huán)境下的存活時(shí)間，以此作為要給予小鼠缺氧時(shí)間的依據(jù)），分為正常組、缺氧模型組、紅景天苷組（360 mg/kg）、西歸粗多糖低劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（200 mg/kg）、高劑量組（400 mg/kg）。紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組灌胃相對(duì)應(yīng)的藥物8 d（由于此次實(shí)驗(yàn)對(duì)象為另外一批小鼠，其在同樣密閉缺氧環(huán)境下的存活時(shí)間可能會(huì)與第一批有所不同，為保證實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)性，在給藥第7天時(shí)需要重新測(cè)定小鼠在缺氧環(huán)境下的存活時(shí)間，故需持續(xù)給藥8 d），1次/d，每次0.2 mL/10 g，正常組和缺氧模型組灌胃相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照。在第7天給藥30 min后，除正常組外，每組隨機(jī)抽取3只重復(fù)第一批次的實(shí)驗(yàn)，記錄其存活時(shí)間，確定缺氧時(shí)間為20min。

2.4 小鼠在缺氧環(huán)境下存活時(shí)間的測(cè)定第一批小鼠末次給藥30 min后，將所有小鼠放入裝有10 g鈉石灰（成分同上）的250 mL廣口瓶中（1只/瓶），瓶口取適量凡士林密封，記錄小鼠的存活時(shí)間。

2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定第二批小鼠第8天給藥30 min后，將除正常組以外其他各組小鼠按照平行實(shí)驗(yàn)的方法放入裝有10 g鈉石灰（成分同上）的250 mL廣口瓶中（1只/瓶），瓶口取適量凡士林涂抹，密封，給予20 min缺氧時(shí)間。20 min后，將小鼠從廣口瓶中取出，所有小鼠眼竇靜脈叢采血，血液4℃靜置30 min，分離血清（4℃，3 000 r/min，10 min）后，根據(jù)試劑盒操作說明書，分別測(cè)定血清中SOD、GSH-Px、AChE活性，MDA及NO含量。同時(shí)處死小鼠并取出肝臟，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗，取其相同部位約200 mg（（200±5）mg），在4℃下加0.9%氯化鈉溶液1.8 mL，用玻璃勻漿器研磨成組織勻漿〔11-14〕，按各試劑盒說明書測(cè)定SOD、GSH-Px、AChE活性及MDA含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以（x±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 西歸粗多糖含量的測(cè)定制得西歸粗多糖（灰白色粉末狀）320 g，提取率為32.00%。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)得該樣品中多糖的含量為727.80 mg/g，純度為72.78%。

3.2 西歸粗多糖對(duì)小鼠缺氧環(huán)境中存活時(shí)間的影響紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組小鼠的存活時(shí)間均比缺氧模型組長(zhǎng)（P＜0.05），說明給藥后可以延長(zhǎng)小鼠在缺氧環(huán)境中的存活時(shí)間。西歸粗多糖中劑量組小鼠存活時(shí)間與紅景天苷組相近，而西歸粗多糖高劑量組小鼠的存活時(shí)間遠(yuǎn)超過紅景天苷組（P＜0.01）。說明西歸粗多糖可以延長(zhǎng)小鼠在缺氧環(huán)境中的存活時(shí)間，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 西歸粗多糖對(duì)小鼠缺氧環(huán)境中存活時(shí)間的影響（x±s，n=10）

3.3 西歸粗多糖對(duì)小鼠血清中NO含量、AChE活性及MDA含量的影響與缺氧模型組相比，紅景天苷組、西歸粗多糖中、高劑量組小鼠血清中NO含量和AChE活性均下降（P＜0.05）；紅景天苷組及西歸粗多糖各劑量組小鼠血清中MDA含量均降低（P＜0.01），且西歸粗多糖各劑量組呈劑量依賴性降低。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖各劑量組小鼠血清中NO含量有所升高（P＜0.05）；西歸粗多糖中劑量組小鼠血清中AChE活性與紅景天苷組相近，而西歸粗多糖高劑量組小鼠血清中AChE活性比紅景天苷組還低（P＜0.05）；西歸粗多糖中、高劑量組小鼠血清中MDA含量比紅景天苷組低（P＜0.01）。結(jié)果表明西歸粗多糖可有效減少小鼠血清中NO含量，降低AChE活性及MDA含量。見表2。

表2 西歸粗多糖對(duì)小鼠血清中NO含量、AChE活性及MDA含量的影響（x±s，n=10）

3.4 西歸粗多糖對(duì)小鼠血清中SOD和GSH-Px活性的影響與缺氧模型組相比，紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組均可提高小鼠血清中SOD活性，其中紅景天苷組和西歸粗多糖高劑量組作用明顯（P＜0.05）；紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組均可有效提高小鼠血清中GSH-Px活性（P＜0.05），且西歸粗多糖各劑量組呈劑量依賴性增加。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖高劑量組的SOD活性更高（P＜0.05）；西歸粗多糖各劑量組的GSH-Px活性都比紅景天苷組高（P＜0.05），尤其是西歸粗多糖中、高劑量組的GSH-Px活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紅景天苷組。說明西歸粗多糖可以提高小鼠血清中SOD和GSH-Px活性。見表3。

表3 西歸粗多糖對(duì)小鼠血清中SOD和GSH-Px活性的影響（x±s，n=10）

3.5 西歸粗多糖對(duì)小鼠肝臟組織中AChE活性及MDA含量的影響與缺氧模型組相比，西歸粗多糖中劑量組小鼠肝臟組織中AChE活性降低（P＜0.05）；紅景天苷組、西歸粗多糖中、高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量均有所下降，且西歸粗多糖高劑量組與缺氧模型組小鼠肝臟組織中MDA含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖高劑量組小鼠肝臟組織中MDA含量明顯減少（P＜0.05）。提示西歸多糖可以降低小鼠肝臟組織中AChE活性，減少M(fèi)DA含量。見表4。

表4 西歸粗多糖對(duì)小鼠肝臟組織中AChE活性及MDA含量的影響（x±s，n=10）

3.6 西歸粗多糖對(duì)小鼠肝臟組織中SOD和GSHPx活性的影響與缺氧模型組相比，紅景天苷組和西歸粗多糖各劑量組小鼠肝臟組織中SOD活性增加，且西歸粗多糖中、高劑量組與缺氧模型組小鼠肝臟組織中SOD活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；紅景天苷組及西歸粗多糖中、高劑量組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性均增加，且西歸粗多糖高劑量組與缺氧模型組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與紅景天苷組相比，西歸粗多糖中劑量組小鼠肝臟組織中SOD活性與之相近，西歸粗多糖高劑量組小鼠肝臟組織中SOD活性增加更明顯（P＜0.05）；西歸粗多糖高劑量組小鼠肝臟組織中GSH-Px活性比紅景天苷組更高（P＜0.01）。說明西歸粗多糖不僅有效提高小鼠肝臟組織中SOD活性，同時(shí)也能提高小鼠肝臟組織中的GSH-Px活性。見表5。

表5 西歸粗多糖對(duì)小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px活性的影響（x±s，n=10）

4 討論

缺氧是一種病理過程，即組織的氧氣供給不足或利用阻礙都會(huì)導(dǎo)致組織的代謝、功能以及形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異樣變化〔15〕。通過測(cè)定小鼠在缺氧環(huán)境中的存活時(shí)間可以確定小鼠對(duì)缺氧的耐受力，小鼠的存活時(shí)間與小鼠的抗缺氧能力呈正相關(guān)，小鼠存活時(shí)間長(zhǎng)說明具有良好的抗氧化應(yīng)激能力〔16〕。本研究顯示，西歸粗多糖各劑量組均能延長(zhǎng)小鼠在缺氧環(huán)境下的存活時(shí)間，并且西歸粗多糖高劑量組小鼠存活時(shí)間更是遠(yuǎn)超過紅景天苷組，提示西歸粗多糖可能具有抗缺氧作用。推測(cè)這種作用可能是小鼠在缺氧環(huán)境下對(duì)氧的利用能力被提高，用以彌補(bǔ)氧氣供給不足或利用阻礙帶來的缺陷，減緩了小鼠因缺氧而引起組織機(jī)能損傷狀況的速度，提高小鼠的抗缺氧能力，進(jìn)而延長(zhǎng)小鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時(shí)間。為驗(yàn)證這個(gè)猜測(cè)，我們?cè)O(shè)計(jì)了接下來的一系列氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定試驗(yàn)。

SOD可以將生物體內(nèi)活性氧自由基轉(zhuǎn)換為氧氣和過氧化物，檢測(cè)SOD的含量可以反映機(jī)體活性氧自由基的清除率〔17〕。GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化酶，它可阻斷活性氧自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷〔18〕。機(jī)體缺氧會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，從而消耗SOD及GSH-Px并抑制其活性，故發(fā)生脂質(zhì)過氧化后產(chǎn)生大量的MDA〔14〕。因此，MDA也常常作為反映氧化損傷程度的標(biāo)志物〔19-21〕，大量的MDA會(huì)破壞生物膜的完整性，加劇膜損傷。本研究表明，在缺氧狀態(tài)下，用西歸粗多糖預(yù)防給藥后，小鼠肝臟和血清中SOD活性和GSH-Px活性均升高，而MDA的含量降低，表明西歸粗多糖可有效治療因氧化應(yīng)激而引起的損傷。

研究表明，在正常情況下，NO對(duì)于神經(jīng)的作用具有兩面性，既可起到保護(hù)作用，又可毒害神經(jīng)〔22〕。在NO高濃度下，二氧化氮自由基、羥自由基會(huì)大量產(chǎn)生，從而使蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞膜遭到破壞，線粒體損傷加劇，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡〔23〕。故此，降低NO的濃度，可明顯增加抗氧化能力，從而減少氧化應(yīng)激引起的損傷。本研究表明，西歸粗多糖高劑量組可以有效降低小鼠血清中NO的含量，這與多項(xiàng)研究結(jié)果一致〔24-26〕。而低劑量組的NO含量比缺氧模型組高，這可能是小鼠缺氧時(shí)，NO含量還受到其他代償調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響小鼠血清中NO的含量。

AChE是乙酰膽堿的一種水解酶。肝臟生成膽堿酶后分泌入血，所以肝受損害的程度可由膽堿酶的表達(dá)量來反映。本研究數(shù)據(jù)顯示，西歸粗多糖對(duì)小鼠缺氧狀態(tài)下肝細(xì)胞和血清中AChE的活性有一定影響，主要是緩解小鼠在缺氧時(shí)組織細(xì)胞的損傷程度，提高氧的利用能力。另外，課題組前期的研究表明西歸粗多糖也可以通過調(diào)節(jié)免疫功能和免疫平衡，減輕肝臟損傷，對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞發(fā)揮積極的免疫調(diào)節(jié)作用〔27〕，這兩條對(duì)肝臟調(diào)節(jié)路徑之間的相互作用還需要深入研究。

綜上所述，本研究表明西歸粗多糖可以通過增強(qiáng)缺氧小鼠SOD及GSH-Px活性，降低小鼠的AChE活性，減少M(fèi)DA及NO含量，減輕小鼠體內(nèi)自由基的氧化損傷，從而對(duì)缺氧條件下的小鼠提供保護(hù)?？傊鳉w粗多糖具有抗缺氧作用，可能與其可減輕氧化損傷的作用有關(guān)。但本研究?jī)H僅是初步探索了西歸粗多糖3個(gè)劑量組與抗氧化作用的關(guān)系，因西歸粗多糖分子質(zhì)量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，提取純度并沒有達(dá)到100%，所以具體到抗氧化作用的發(fā)揮是與西歸粗多糖的哪些結(jié)構(gòu)部位有關(guān)及作用于哪些生物信號(hào)等都需要進(jìn)一步研究。