陳亞男，石少敏，付 姿，劉漢福，姜 北，，沈 磊，*

（1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），云南大理 671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

鞍葉羊蹄甲Bauhinia brachycarpaBenth.，又名馬蹄葉、大葉羊蹄甲、馬蹄飛等，屬于豆科羊蹄甲屬植物，全國(guó)多地均有分布，以云南分布最廣，為白族的一種民間用藥。白族用藥記載鞍葉羊蹄甲可抗炎、疏通經(jīng)絡(luò)、治療筋骨疼痛等〔1〕。課題組前期對(duì)84種滇西藥用植物進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)鞍葉羊蹄甲對(duì)醋酸誘導(dǎo)的外周炎性疼痛的鎮(zhèn)痛活性最為顯著，對(duì)熱板所致的中樞性疼痛也有明顯鎮(zhèn)痛作用，可作為鎮(zhèn)痛藥使用〔2〕。目前主流的鎮(zhèn)痛藥療效肯定，但是不良反應(yīng)較多，有的甚至還有成癮性〔3〕。鎮(zhèn)痛藥多具有中樞系統(tǒng)的不良反應(yīng)，如中樞抑制、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力失衡、肌無(wú)力等〔4〕。鞍葉羊蹄甲可以作為鎮(zhèn)痛藥使用，但目前尚無(wú)報(bào)道研究其用藥安全性。因此，本研究擬探討鞍葉羊蹄甲的急性毒性，并主要觀(guān)察其對(duì)中樞系統(tǒng)的影響，為鞍葉羊蹄甲的安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全依照大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑鞍葉羊蹄甲于2019年8月采自大理漾濞，由大理大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張德全教授鑒定為豆科羊蹄甲屬植物鞍葉羊蹄甲B.brachycarpaBenth.，經(jīng)95%乙醇提取為粗提物后制成凍干粉，實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）制成混懸液供灌胃使用。水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：Q/12HB 4218-2017）；CMC-Na（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20080523）；4%組織細(xì)胞固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200831）。

1.3 儀器ZZ-6型小鼠自主活動(dòng)儀、ZB-200型疲勞轉(zhuǎn)棒儀（成都泰盟科技有限公司）；全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 對(duì)鞍葉羊蹄甲粗提物的溶解度進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)20 g/kg為0.5%CMC-Na所能溶解粗提物的最大劑量。取昆明種小鼠36只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組6只，分別為溶劑對(duì)照組，鞍葉羊蹄甲粗提物20.0、13.3、8.9、5.9、3.9 g/kg 5個(gè)劑量組，劑間比為1∶1.5。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，然后灌胃不同劑量的粗提物，溶劑對(duì)照組灌胃0.5%CMCNa，灌胃體積均為40 mL/kg，僅灌胃1次。灌胃后連續(xù)觀(guān)察14 d，期間稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量，同時(shí)觀(guān)察小鼠行為學(xué)表現(xiàn)。給藥后第14天，脫臼處死小鼠，取臟器，觀(guān)察有無(wú)病變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與溶劑對(duì)照組比較，給予所有劑量的鞍葉羊蹄甲粗提物后，均未發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，小鼠的體質(zhì)量、行為學(xué)及臟器均無(wú)異常。因此，擬采用最大給藥量法進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

2.2 正式實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分組及給藥 取昆明種小鼠40只，雌雄各半，按行為學(xué)數(shù)據(jù)和體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，每組20只，分別為溶劑對(duì)照組和鞍葉羊蹄甲組。以40 mL/kg的最大給藥體積分別給溶劑對(duì)照組小鼠和鞍葉羊蹄甲組小鼠灌胃0.5%CMC-Na和20 g/kg的鞍葉羊蹄甲粗提物，僅灌胃1次，灌胃后連續(xù)觀(guān)察小鼠反應(yīng)14 d。

2.2.2 指標(biāo)測(cè)定 觀(guān)察并記錄動(dòng)物的毒性反應(yīng)，包括外觀(guān)體征，行為活動(dòng)，精神狀態(tài)，食欲，大小便及顏色，被毛，膚色，呼吸及鼻、眼、口腔、生殖器等有無(wú)異常分泌物等。于給藥前1 d，給藥后1、2、3、5、8、11、14 d稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量，并同時(shí)測(cè)試小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)具體為：（1）于自主活動(dòng)儀記錄小鼠的“站立”次數(shù)（平行測(cè)2次取平均值）以反應(yīng)小鼠自主活動(dòng)次數(shù)。（2）于平衡木上測(cè)試小鼠通過(guò)平衡木的表現(xiàn)以反應(yīng)小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：平穩(wěn)通過(guò)，1分；前肢或后肢滑落，2分；懸掛或抱住平衡木，3分；直接掉落，4分。（3）于疲勞轉(zhuǎn)棒儀記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒儀（30 r/min）上的停留時(shí)間以反應(yīng)小鼠的抗疲勞能力。給藥14 d后，眼后靜脈叢取血，通過(guò)全自動(dòng)動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀測(cè)定血液生化指標(biāo)，然后脫臼處死小鼠，取臟器稱(chēng)量，計(jì)算臟器指數(shù)：臟器指數(shù)（%）=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；并取肝、腎、心、腦組織放入4%多聚甲醛中固定后送大理白族自治州人民醫(yī)院病理科進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀(guān)察組織病理學(xué)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用（x±s）表示。計(jì)量資料用LSD法比較組間差異；計(jì)數(shù)資料用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠體質(zhì)量和一般表現(xiàn)的影響給予鞍葉羊蹄甲后，小鼠的一般表現(xiàn)，包括外觀(guān)、飲食、活動(dòng)表現(xiàn)、分泌物等未見(jiàn)異常。與溶劑對(duì)照組相比，除了在給藥第14天鞍葉羊蹄甲組小鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余測(cè)量時(shí)間點(diǎn)鞍葉羊蹄甲組小鼠的體質(zhì)量均無(wú)顯著變化，說(shuō)明鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠體質(zhì)量基本無(wú)影響。見(jiàn)表1。

表1 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（x±s，n=20）

3.2 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠行為學(xué)的影響本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的小鼠行為學(xué)主要包括自主活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和抗疲勞能力，分別用自主活動(dòng)次數(shù)、平衡木評(píng)分和在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上的停留時(shí)間評(píng)價(jià)。與溶劑對(duì)照組相比，給予鞍葉羊蹄甲1 d后，小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)無(wú)顯著變化；小鼠的平衡木評(píng)分以及在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上的停留時(shí)間無(wú)顯著差異。說(shuō)明剛開(kāi)始給予鞍葉羊蹄甲時(shí)會(huì)對(duì)小鼠的自主活動(dòng)產(chǎn)生一定的抑制作用，除此外，鞍葉羊蹄甲不會(huì)對(duì)小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)產(chǎn)生影響。見(jiàn)表2。

表2 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠行為學(xué)的影響（x±s，n=20）

3.3 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠臟器指數(shù)和主要血液生化指標(biāo)的影響與溶劑對(duì)照組相比，鞍葉羊蹄甲組小鼠的臟器指數(shù)和主要血液生化指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠的主要臟器和血液指標(biāo)無(wú)明顯影響。見(jiàn)表3～4。

表3 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響（x±s，n=20）

3.4 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠臟器組織的影響臟器組織切片HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。與溶劑對(duì)照組相比，鞍葉羊蹄甲組小鼠的肝、腎、心、腦未見(jiàn)明顯病理變化，進(jìn)一步說(shuō)明鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠臟器無(wú)明顯毒副作用。

表4 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠主要血液生化指標(biāo)的影響（x±s，n=20）

圖1 鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠臟器組織的影響（×400，標(biāo)尺為50μm）

4 討論

本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最大給藥量的鞍葉羊蹄甲未造成小鼠死亡，因此采用最大給藥量法評(píng)估鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠的急性毒性作用。結(jié)果表明：20 g/kg的鞍葉羊蹄甲基本沒(méi)有急性毒性作用。首先，鞍葉羊蹄甲對(duì)小鼠的進(jìn)食無(wú)明顯影響，與溶劑對(duì)照組相比，僅在第14天時(shí)鞍葉羊蹄甲組小鼠體質(zhì)量有所降低，其余時(shí)間段內(nèi)體質(zhì)量差異不明顯。其次，鞍葉羊蹄甲對(duì)主要臟器無(wú)明顯的毒副作用，無(wú)論是臟器指數(shù)還是臟器組織切片均未見(jiàn)顯著變化。鞍葉羊蹄甲對(duì)主要的血液生化指標(biāo)也沒(méi)有明顯的影響，說(shuō)明其對(duì)小鼠的運(yùn)送氧氣功能、免疫功能無(wú)顯著毒性，但要注意鞍葉羊蹄甲能一定程度地升高小鼠的血小板計(jì)數(shù)，盡管差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，還是需要在用藥后密切注意其可能的促血栓作用〔5〕。由于鞍葉羊蹄甲可能通過(guò)外周抗炎起鎮(zhèn)痛作用，其與非甾體抗炎藥對(duì)血小板的作用也需要做一定的比較。鞍葉羊蹄甲對(duì)于其余急性毒性指標(biāo)，如外觀(guān)、活動(dòng)、分泌物排泄等均沒(méi)有明顯影響，說(shuō)明鞍葉羊蹄甲的安全性較高，對(duì)動(dòng)物的主要臟器功能均相對(duì)安全。

鎮(zhèn)痛藥物普遍存在中樞毒性〔6〕，如阿片類(lèi)藥物引起鎮(zhèn)靜、眩暈、肌肉痙攣、惡心嘔吐和成癮；非阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥物曲馬多引起中樞抑制和無(wú)力；治療胃腸絞痛的阿托品引起中樞興奮及隨后的中樞抑制；治療神經(jīng)痛藥物卡馬西平引起眩暈、共濟(jì)失調(diào)等。鞍葉羊蹄甲對(duì)中樞性疼痛也有一定的作用。因此，本研究著重考察了鞍葉羊蹄甲對(duì)中樞系統(tǒng)的影響，采用自主活動(dòng)儀、平衡木和疲勞轉(zhuǎn)棒儀評(píng)價(jià)用藥后小鼠的自主活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和平衡能力、抗疲勞和平衡控制能力。結(jié)果表明，鞍葉羊蹄甲不會(huì)影響小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、平衡控制和抗疲勞能力，但是在用藥后第1天小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)顯著減少，并在觀(guān)察期間小鼠的自主活動(dòng)均降低，說(shuō)明鞍葉羊蹄甲有一定的中樞抑制效應(yīng)，需要在用藥期間注意監(jiān)控。

20 g/kg的鞍葉羊蹄甲換算為成年人（60 kg）的用量約為1 320 g生藥（按小鼠劑量折算系數(shù)為1，人劑量系數(shù)折算為0.11〔7〕31，生藥到凍干粉提取率為10%計(jì)算），在實(shí)際用藥中無(wú)法達(dá)到，因此，總體而言，治療劑量的鞍葉羊蹄甲（長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的低劑量一般設(shè)計(jì)為最大耐受量的1/10〔7〕112，這里假定治療量為最大耐受量的1/20，即1 g/kg）基本無(wú)急性毒性。由于鞍葉羊蹄甲主要用于慢性疼痛，如炎性疼痛和神經(jīng)痛，其長(zhǎng)期毒性需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估。