肖舒珺,吳紅宇,趙廣生,胡鋼亮,袁海娜,肖功年

(1.浙江科技學院 生物與化學工程學院,浙江 杭州 310023;2.杭州千島湖康諾邦健康產(chǎn)品有限公司,浙江 杭州 311705;3.杭州新希望雙峰乳業(yè)有限公司農(nóng)業(yè)部國家乳制品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,浙江 杭州 311100)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一種重要的腸道菌群微生物,對維持人類腸道微生態(tài)穩(wěn)定起到非常關(guān)鍵的作用[1]。植物乳桿菌是一種革蘭氏陽性厭氧菌,通常能夠在許多發(fā)酵食品中被發(fā)現(xiàn),是乳酸菌中的重要菌種[2-3],因其具有益特性,所以被選擇用于益生菌發(fā)酵乳的制造。研究表明:植物乳桿菌與人們的生活有著密切聯(lián)系,它可以定植于人體腸道[4],抑制腸道致病菌[5-6],對增強機體免疫力[7-8]也有重要作用。枇杷果實酸甜可口、柔軟多汁,并且富含多種營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)[9]。目前,國內(nèi)雖然有關(guān)于植物乳桿菌培養(yǎng)的營養(yǎng)特性的報道[10],但與枇杷果粉的協(xié)同作用方面的研究報道卻很少。

從菌落形態(tài)差異及生長特性出發(fā),通過單因素試驗對植物乳桿菌在添加不同質(zhì)量濃度枇杷果粉的MRS培養(yǎng)基中的生長情況進行考察,研究了不同質(zhì)量濃度的枇杷果粉對植物乳桿菌生長的影響及其共生特性,為枇杷果粉的高值化利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種:植物乳桿菌(LactobacillusplantarumKCTC3104),由浙江科技學院生物與化學工程學院實驗室分離并保存。

試劑:MRS肉湯,杭州百思生物技術(shù)有限公司;MRS瓊脂,杭州百思生物技術(shù)有限公司;瓊脂,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;枇杷果粉:杭州千島湖康諾邦健康產(chǎn)品有限公司;大豆蛋白,上海博微生物試劑有限公司;胰蛋白,上海博微生物試劑有限公司;脲,分析純AR,國藥集團化學試劑有限公司;蔗糖,分析純AR,上海展云化工有限公司。

儀器與設(shè)備:YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈工作臺,蘇州蘇凈集團有限公司;HWS型恒溫恒濕器,寧波東南儀器有限公司;FA2004N電子天平,上海菁海儀器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;UV-5200PC紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同枇杷果粉添加量下的植物乳桿菌菌落形態(tài)

1) 菌種的活化

菌種活化參照文獻[11]進行,稱取MRS肉湯5.22 g溶于100 mL水中,振蕩搖勻,使其完全溶解,分裝到若干試管中加塞滅菌,待冷卻后在超凈工作臺上用移液槍移取0.1 mL菌液至試管中,將接種完的試管置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2) 鏡檢(革蘭氏染色)

取完成培養(yǎng)的菌種常規(guī)涂片,干燥,并固定。滴加結(jié)晶紫染液染色1～2 min,水洗。用碘液沖洗至無殘液,并用碘液覆蓋約1 min后水洗。用濾紙吸去載玻片上殘液,并用95%乙醇脫色,至流出液無紫色時(一般用時為20～30 s),立即水洗。用番紅液復染約2 min后水洗,干燥后用油鏡觀察,被染成藍紫色的菌體是植物乳桿菌。

3) 培養(yǎng)基配制及倒平板

稱取6份質(zhì)量為6.4 g的MRS培養(yǎng)基,溶于6個裝有100 mL水的錐形瓶中,用電子天平分別稱取枇杷果粉添加量為0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g于錐形瓶中,分別標注為1#～6#,振蕩搖勻,放入高壓蒸汽滅菌鍋(121 ℃)滅菌15 min。滅菌完畢后取出冷卻到50 ℃,在超凈工作臺倒平板,待培養(yǎng)基冷卻凝固后倒置。

表3為加入置信機制的KNN算法中的部分樣例數(shù)據(jù)，#為測試樣本分在該類別時樣本中大于該測試樣本奇異值的數(shù)量，從圖1可知其值越大，置信度越大。

4) 單菌落分離實驗

單菌落分離實驗參照文獻[12]進行,使用接種環(huán)以無菌操作沾取少許植物乳桿菌,在無菌平板表面進行平行劃線,倒置培養(yǎng)皿于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后觀察分離效果。

1.2.2 不同枇杷果粉添加量下的植物乳桿菌生長活力測定

1) 培養(yǎng)基配制

稱取MRS肉湯5.22 g及瓊脂質(zhì)量分數(shù)為0.5%,分別稱取枇杷果粉添加量為0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g于錐形瓶中,分別標注為1#～6#,溶于100 mL水中,振蕩搖勻,使其完全溶解,分裝到若干試管中加塞滅菌。

2) 接 種

待培養(yǎng)基冷卻后,在超凈工作臺上用接種針蘸取少量活化后的植物乳桿菌并穿刺至試管中,將接種完成的試管置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 不同枇杷果粉添加量下的植物乳桿菌生長趨勢測定

1) 培養(yǎng)基配制

稱取MRS肉湯5.22 g于100 mL水中,分別稱取枇杷果粉添加量0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g于錐形瓶中,分別標注為1#～6#,溶于100 mL水中,振蕩搖勻,使其完全溶解,分裝到若干試管中加塞滅菌。

2) 接種和測量

用移液槍移取菌液0.1 mL于試管中,并設(shè)置對照組,接種完后以0添加量對照組對分光光度計(分光光度值A(chǔ)595)進行調(diào)零,然后對各濃度試管進行分光光度進行測量,每隔4 h測量1次。

1.2.4 枇杷果粉作用下不同碳氮源對植物乳桿菌生長情況的影響

1) 培養(yǎng)基配制

稱取MRS肉湯5.22 g及枇杷果粉1.0 g于100 mL水中,并分別稱取質(zhì)量大豆蛋白0.5 g、胰蛋白0.5 g、脲0.5 g、蔗糖0.5 g于錐形瓶中,標號,溶于100 mL水中,振蕩搖勻,使其完全溶解,分裝到若干試管中加塞滅菌。

2) 接種和測量

同1.2.3方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)

根據(jù)乳酸菌的形態(tài)學特征[13],菌落經(jīng)革蘭氏染色,得到藍紫色桿菌,故鑒定為植物乳桿菌。通過劃線分離法得到呈單個、成對或短鏈狀的植物乳桿菌。菌落表面無芽孢,直徑約3 mm,凸起,表面光滑,呈藍紫色。在10×100油鏡下可觀察到經(jīng)革蘭氏染色后呈藍紫色,結(jié)果如圖1所示。

圖1 植物乳桿菌革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Gram staining results of Lactobacillus plantarum

在不同質(zhì)量濃度枇杷果粉的MRS固體培養(yǎng)基中,對植物乳桿菌菌落的生長形態(tài)進行分析,其植物乳桿菌菌落形態(tài)如圖2所示。圖2中,編號1為0 g枇杷果粉添加量的MRS培養(yǎng)基,編號2～6分別為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g枇杷果粉添加量的MRS培養(yǎng)基。由圖2可知:枇杷果粉添加量為0.5～2.0 g時,對植物乳桿菌的生長略有抑制作用;枇杷果粉添加量為2.5 g時,對植物乳桿菌生長的影響不大。

圖2 不同枇杷果粉添加量下MRS培養(yǎng)基中 植物乳桿菌菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Lactobacillus plantarum in MRS medium with different loquat fruit powder addition

2.2 不同枇杷果粉添加量下的植物乳桿菌生長活力測定

植物乳桿菌在果粉MRS半固體培養(yǎng)基中,均沿穿刺路徑生長,并向四周生長延伸?；谥参锶闂U菌的生長情況分析如表1所示,枇杷果粉對植物乳桿菌的生長雖然略有抑制作用,但抑制作用不是很明顯,與1.2.1節(jié)的實驗結(jié)果相符合。

表1 植物乳桿菌在MRS半固體培養(yǎng)基 中的生長情況表

2. ++代表生長情況較佳。

3. +++代表生長情況良好。

2.3 不同枇杷果粉添加量下的植物乳桿菌生長趨勢測定

不同質(zhì)量濃度枇杷果粉對植物乳桿菌生長速度的影響實驗結(jié)果如圖3所示,經(jīng)過一段時間的培養(yǎng),植物乳桿菌的大量繁殖雖然使得MRS液體培養(yǎng)基變渾濁,分光光度值上升,但添加枇杷果粉組植物乳桿菌分光光度均低于未添加枇杷果粉組。

圖3 不同添加量枇杷果粉對植物乳桿菌生長速度的影響Fig.3 Effect of loquat fruit powder with different dosage on growth rate of Lactobacillus plantarum

由圖3可知:不同添加量枇杷果粉下植物乳桿菌的生長基本符合“J”型曲線,未添加枇杷果粉組植物乳桿菌的生長情況明顯好于添加枇杷果粉組,且枇杷果粉的添加使得植物乳桿菌生長受到不同程度的抑制;枇杷果粉對植物乳桿菌在0～12 h內(nèi)的生長略有抑制作用,且6～12 h枇杷果粉對植物乳桿菌生長的抑制作用較為明顯,與1.2.1,1.2.2節(jié)的實驗結(jié)果基本吻合。

2.4 枇杷果粉作用下不同碳氮源對植物乳桿菌生長情況的影響

枇杷果粉作用下不同碳源和氮源對植物乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中生長情況的影響如圖4所示。不同碳源和氮源對植物乳桿菌生長情況的影響不同,與單純的MRS液體培養(yǎng)基相比,由于MRS液體培養(yǎng)基加了大豆蛋白、胰蛋白、脲和蔗糖,植物乳桿菌的生長情況均較好。

圖4 不同碳氮源對植物乳桿菌生長速度的影響Fig.4 Effect of different carbon and nitrogen sources on growth rate of Lactobacillus plantarum

從圖4中可以看出:枇杷果粉作用下不同碳源和氮源對植物乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中生長情況基本符合“J”型曲線,其中大豆蛋白對植物乳桿菌的生長有較好的促進作用,能夠顯著促進植物乳桿菌生長;胰蛋白對植物乳桿菌的生長也起到一定的促進作用;單一的脲和蔗糖對植物乳桿菌的生長并未有明顯的促進作用。

3 結(jié) 論

從菌落形態(tài)差異及生長特性出發(fā),研究了添加不同質(zhì)量濃度枇杷果粉的MRS培養(yǎng)基中的植物乳桿菌生長情況及趨勢,以及在枇杷果粉作用下不同碳源、氮源對MRS液體培養(yǎng)基中植物乳桿菌生長情況的影響。結(jié)果表明:在0～12 h,枇杷果粉對植物乳桿菌的生長略有抑制作用,在6～12 h,枇杷果粉對植物乳桿菌生長的抑制作用較為明顯;大豆蛋白對植物乳桿菌的生長情況有較為明顯的促進作用;胰蛋白對植物乳桿菌的生長促進作用略次于大豆蛋白,而單一的脲和蔗糖對植物乳桿菌生長并無明顯促進作用。根據(jù)枇杷果粉在不同應用中的需求,還需要對益生特性的優(yōu)勢方面作更深一步的探究,以求發(fā)揮其最大作用。