白長勝

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)分院,黑龍江 齊齊哈爾 161005)

乳酸菌是我國飼料添加劑品種目錄(2013)中允許在養(yǎng)殖動物過程中使用的主要益生菌。在養(yǎng)殖家禽過程中,飼喂乳酸菌可維持消化道微生態(tài)平衡,拮抗和抑制腸道有害菌;提高免疫力,增強抗病力;提高家禽對飼料的消化吸收,促進家禽生長[1-3]。乳酸菌在家禽生產(chǎn)中的應用前景十分廣闊,因此研究和開發(fā)禽用乳酸菌制劑具有重要意義。

乳酸菌活菌制劑要充分發(fā)揮其生產(chǎn)性能,實現(xiàn)良好的益生作用,需要有足夠的活菌數(shù)[4]。乳酸菌種類眾多、性狀差異較大[5],因此針對特定的乳酸菌有必要對其發(fā)酵工藝進行系統(tǒng)優(yōu)化,才能充分發(fā)揮其性能。溫度影響菌體生長和酶活,pH影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶活,接種量影響生長周期,因而研究出合適的發(fā)酵條件降低成本和縮短生產(chǎn)周期,才能推動其在工業(yè)中的應用。筆者針對篩選到的一株禽用乳酸菌SR1,通過單因素和正交實驗,優(yōu)化乳酸菌SR1的培養(yǎng)條件,為SR1在禽的養(yǎng)殖過程中的推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

乳酸菌SR1,經(jīng)鑒定為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici),保存在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院微生物實驗室。

1.1.2 試 劑

葡萄糖,K2HPO4,MgSO4為國藥試劑分析純;牛肉膏,蛋白胨為國藥試劑生化純。

1.1.3 培 養(yǎng) 基

乳酸菌計數(shù)培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖30 g/L,牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,K2HPO42 g/L,MgSO40.2 g/L。

1.2 儀 器

ME104電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HW-80電熱恒溫培養(yǎng)箱,杭州綠博儀器有限公司;DL-CJ-2ND超凈工作臺,北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司;UV-5200紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;YXQ-LS-30SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器,上海博迅實業(yè)有限公司;FE20K實驗室pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 初始發(fā)酵條件

將SR1菌株活化,挑取1環(huán)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,在35 ℃條件下,靜置培養(yǎng)24 h;按體積分數(shù)為2%接種于新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中,35 ℃下靜置培養(yǎng)24 h。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素實驗

以發(fā)酵液中OD660為考核指標,研究因素分別為A(溫度)、B(接種量)和C(初始pH)對乳酸菌SR1發(fā)酵的影響[5-7]。其中溫度分別為20,25,30,35,40,45,50 ℃;接種量分別為1%,3%,5%,7%,9%;初始pH分別為3,3.5,4,4.5,5,5.5,6,6.5,7,7.5。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交實驗

單因素實驗結(jié)果溫度為40 ℃,接種量為6%,初始pH為6,根據(jù)發(fā)酵條件單因素優(yōu)化實驗結(jié)果,設計3因素3水平的L9(33)正交實驗,進一步優(yōu)化SR1發(fā)酵條件[5-7],正交實驗設計如表1所示。

表1 乳酸菌SR1發(fā)酵條件優(yōu)化正交實驗設計表

1.3.4 驗證實驗

根據(jù)正交實驗優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行SR1發(fā)酵實驗,與采用原始發(fā)酵條件的發(fā)酵結(jié)果進行比較。

1.3.5 檢測條件確定

以自來水作為空白對照調(diào)零,測定發(fā)酵培養(yǎng)基和乳酸菌SR1發(fā)酵液在不同波長下的OD值,確定乳酸菌SR1的最適吸收波長[8]。

將SR1發(fā)酵液用發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋,以未接種發(fā)酵培養(yǎng)基作空白對照,測定各稀釋度SR1發(fā)酵液在最適吸收波長條件下的OD值;同時各稀釋度發(fā)酵液進行活菌計數(shù),建立活菌數(shù)和OD之間的直線回歸方程。

1.3.6 分析方法

1) 菌液濃度測定,分光光度計測定OD660值;2) pH直接用pH計測定;3) 活菌計數(shù)[9-11],發(fā)酵液梯度稀釋后,選取適宜稀釋度的發(fā)酵液涂布MRS平板,35 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel繪圖,采用SPSS對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件確定

不同的菌液,最適吸收波長不同。對乳酸菌的相關研究中,通常采用600 nm波長測定菌液OD,本研究通過實驗確定SR1的最適吸收波長為660 nm。

在一定OD范圍內(nèi),發(fā)酵液的活菌數(shù)與OD之間成線性關系。通過實驗建立SR1活菌數(shù)與OD660的直線回歸方程:y=2.147x-0.017,R2=0.998。x=OD,y=活菌數(shù)(108CFU/mL),OD為0.2～1.6,SR1發(fā)酵液的OD與活菌數(shù)之間呈線性關系。測定SR1菌液的OD值可以快捷、準確地知道活菌數(shù)。

2.2 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

2.2.1 溫度對SR1發(fā)酵的影響

溫度影響微生物體內(nèi)的許多生化反應,從而影響微生物的代謝活動。低溫時菌體生長繁殖受到抑制,在一定溫度范圍內(nèi),隨著溫度升高,生化反應速率加快,超過一定溫度限度,菌體受到抑制,甚至死亡。溫度對SR1發(fā)酵的影響如圖1所示。

圖1 溫度對SR1發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of temperature on SR1 fermentation

由圖1可知:當溫度從20 ℃升高到40 ℃時,OD660從0.295增加到1.431,提高了4.85倍;之后溫度繼續(xù)上升,OD660迅速下降,在50 ℃時降到0.168,只有最高值的24%,可見培養(yǎng)溫度過高或過低都會對乳酸片球菌SR1的生長產(chǎn)生顯著影響,可能是溫度影響微生物體內(nèi)生化反應過程中酶的活性,進而影響微生物的生長代謝。故選擇SR1最適發(fā)酵溫度為40 ℃。

2.2.2 接種量對SR1發(fā)酵的影響

接種量的多少直接影響發(fā)酵周期。一般情況下,接種量和微生物的生長過程的適應期成反比,接種量過少導致發(fā)酵周期延長,接種量增加則發(fā)酵周期減少,但是接種量過多也沒有必要,因為種子培養(yǎng)費時,且由于移入的代謝產(chǎn)物過多,改變了發(fā)酵培養(yǎng)基的初始環(huán)境,也可能延緩菌體早期的生長,從而影響正常發(fā)酵。接種量對SR1發(fā)酵的影響如圖2所示。

圖2 接種量對SR1發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of inoculation amount on SR1 fermentation

由圖2可知:隨著接種量的增加,乳酸菌SR1的OD660不斷增加,在接種量為6%時,OD660達到最大,然后隨著接種量繼續(xù)增加,OD660逐漸下降。其原因可能是接種量在6%時,菌體可充分利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分,接種量大于或小于6%均不利于菌株生長;綜合來看,當接種量為2%～10%,對OD660的影響不大?？紤]到在接種量為6%時,OD660相對最高,因此選擇6%為最佳接種量。

2.2.3 初始pH對SR1發(fā)酵的影響

pH影響微生物體內(nèi)酶的活性,從而影響菌體的新陳代謝;pH影響細胞膜所帶電荷狀態(tài),使細胞膜的通透性改變,從而影響微生物的吸收和排泄;pH影響發(fā)酵培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)成分的解離,從而影響菌體對這些成分的吸收利用,因此各種微生物都有其最適pH值和一定的pH范圍。初始pH對SR1發(fā)酵的影響如圖3所示。

圖3 初始pH對SR1發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of initial pH on SR1 fermentation

由圖3可知:當初始pH為3和3.5時,OD660幾乎為零,說明菌體基本不生長;當pH為4時,OD660為0.053,隨著初始pH的升高,OD660隨之增加,當初始pH為6時,OD660達到最大值,為1.461,是初始pH為4時的27.57倍;然后隨著初始pH繼續(xù)增加,OD660開始逐漸下降,當初始pH為7.5時,OD660為1.321,是最大值的90.42%。當初始pH低于4時,乳酸片球菌SR1生長停滯甚至死亡,在弱堿性至弱酸性環(huán)境下均可以正常生長,在弱酸性環(huán)境更有利于乳酸菌的生長。故選擇SR1最適初始pH為6。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以OD660值為考察指標,進行3因素3水平正交實驗。發(fā)酵條件優(yōu)化正交實驗結(jié)果與分析如表2所示。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交實驗結(jié)果與分析

由表2中極差可知:正交實驗各因素對乳酸片球菌SR1發(fā)酵結(jié)果影響順序為A>C>B,說明溫度和初始pH對乳酸片球菌SR1的發(fā)酵影響顯著。根據(jù)K1,K2和K3,可知SR1發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A3B3C2,即溫度為42 ℃,接種量為7%,初始pH為6。

2.4 驗證實驗

乳酸菌SR1分別采用原始發(fā)酵條件和優(yōu)化后的發(fā)酵條件進行發(fā)酵實驗,發(fā)酵實驗結(jié)果如表3所示。

表3 不同發(fā)酵條件對SR1發(fā)酵的影響

由表3可知:發(fā)酵條件優(yōu)化后,OD從1.404±0.012提高到1.541±0.011,活菌數(shù)從(3.0±0.025)×108CFU/mL提高到(3.3±0.024)×108CFU/mL,活菌數(shù)差異極顯著(p<0.01),說明優(yōu)化發(fā)酵條件可顯著提高SR1的發(fā)酵液中的活菌數(shù),從而提高SR1的發(fā)酵水平,同時OD和活菌數(shù)符合通過實驗確立的直線回歸方程。

3 結(jié) 論

采用單因素和正交實驗對乳酸片球菌SR1的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,確定最佳發(fā)酵條件:溫度為42 ℃,接種量為7%,初始pH為6,對優(yōu)化結(jié)果進行發(fā)酵實驗驗證,優(yōu)化后OD660從1.404±0.012提高到1.541±0.011,活菌數(shù)從(3.0±0.025)×108CFU/mL提高到(3.3±0.024)×108CFU/mL,提高了10.0%,發(fā)酵條件優(yōu)化前后活菌數(shù)差異極顯著(P<0.01),說明優(yōu)化發(fā)酵條件可以顯著提高SR1發(fā)酵水平,為后期SR1在禽的養(yǎng)殖過程中應用奠定基礎。結(jié)果表明:通常采用600 nm波長檢測乳酸菌液OD,實驗中SR1最適檢測波長為660 nm。不同的微生物檢測波長不同可能與菌體的體積、形狀有關;常用平板計數(shù)法進行活菌計數(shù),該法結(jié)果準確,但操作復雜,不能及時得到結(jié)果。在一定OD范圍內(nèi),菌體的OD與活菌數(shù)之間成線性關系,測定OD可以計算出活菌數(shù),比平板計數(shù)法更便捷、迅速。