胡 超，劉艷麗，許瓊明，李笑然，楊世林

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州 215123)

斑蝥作為傳統(tǒng)的中藥，其單萜化合物斑蝥素是其主要的活性成分，在臨床上對(duì)于多種惡性腫瘤有一定的治療作用，尤其對(duì)肝癌療效顯著[1-2]。斑蝥素雖療效較好但也有一定的毒副作用，且治療劑量與中毒劑量非常相近，因服用斑蝥素導(dǎo)致中毒或死亡的病例時(shí)有報(bào)道[3]。研究報(bào)道[4]，斑蝥素通過(guò)干擾大鼠肝臟甘油磷脂代謝、鞘脂代謝和類固醇激素生物合成誘導(dǎo)肝細(xì)胞及其細(xì)胞器受損，上調(diào)大鼠肝臟中TNF-α、IKK-α、caspase3蛋白表達(dá)引起肝臟炎性浸潤(rùn)、壞死和出血[5]，抑制小鼠肝臟P450酶家族中的CYP2D6和CYP3A4表達(dá)，通過(guò)TLR4、NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[6]，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死和凋亡引起肝臟的損害[7]，人參皂苷Rb1可下調(diào)高脂血癥SD大鼠肝細(xì)胞焦亡相關(guān)因子NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18及mRNA表達(dá)的減輕肝臟損傷和脂質(zhì)沉積[8]。張苗苗[9]對(duì)艾迪注射液(斑蝥、人參、黃芪、刺五加)的“拆-分”方研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1可減輕斑蝥對(duì)QSG-7701(人肝細(xì)胞)細(xì)胞毒作用，但其減毒機(jī)制目前還不清楚。本研究以斑蝥素誘導(dǎo)SD大鼠肝損傷為模型，觀察人參皂苷Rb1對(duì)斑蝥素介導(dǎo)肝損傷的影響，并探討其可能的機(jī)制，為斑蝥素肝臟損傷的干預(yù)及艾迪注射液配伍規(guī)律提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為180～220 g，由上海斯萊克生物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)NO.2013-0003。大鼠飼養(yǎng)在(21±2)℃的動(dòng)物房中，環(huán)境安靜，通風(fēng)良好，光照12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物相關(guān)規(guī)范進(jìn)行操作。

1.1.2 藥物與試劑 斑蝥素，純度>98.8%，由蘇州大學(xué)天然藥物教研室提供；人參皂苷Rb1，純度>95.0%，購(gòu)于江西本草天宮科技有限責(zé)任公司。

1.1.3 試劑與儀器 一抗：p-MAPK Family Kit(批號(hào)：9910)，MAPK Family Kit(批號(hào)：9926)均購(gòu)于美國(guó)CST公司；二抗：羊抗兔多克隆抗體(批號(hào)：111066)和羊抗鼠多克隆抗體(批號(hào)：110692)購(gòu)自美國(guó)KPL公司。BIO-RAD電泳儀，Bio-Rad公司；VCX130型細(xì)胞超聲破碎儀，美國(guó)SONICS公司；LI-COR型紅外激光成像系統(tǒng)，美國(guó)Odssey公司；C8000全自動(dòng)血生化分析儀，美國(guó)雅培公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與模型制備 取雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分為正常組，斑蝥素組(0.56 mg/kg)，斑蝥素(0.56 mg/kg)+人參皂苷Rb1低、高(5、10 mg/kg)劑量組。正常組給予等量的生理鹽水，人參皂苷Rb1提前4天給藥，在第5天至19天，提前1 h給人參皂苷Rb1再給斑蝥素，各組均腹腔注射給藥(0.01 mL/g 體質(zhì)量)，每天記錄動(dòng)物體質(zhì)量，并按照體質(zhì)量調(diào)整給藥量，同時(shí)記錄動(dòng)物死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血5 mL于EP管內(nèi)，4 ℃條件下3 500 r/min 離心15 min，取上清液，用于血生化檢測(cè)。隨機(jī)取3只大鼠的肝臟組織于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中(pH=7.4)固定，再取部分肝臟組織用生理鹽水輕微浸泡洗滌后保存于液氮罐。

1.2.2 血液生化檢測(cè) 取離心后的上清液，用全自動(dòng)血生化分析儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。

1.2.3 組織病理學(xué)檢測(cè) 取用4%多聚甲醛固定后的肝臟組織，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋后，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.2.4 Western blot分析檢測(cè)ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK蛋白表達(dá) 取液氮罐中肝組織稱質(zhì)量后置于冰上的碾缽中研細(xì)，加入含1% PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液勻漿后，4 ℃高速(12 000 r/min)離心10 min，吸取上清液測(cè)蛋白含量，按比例加入5×SDS loading buffer后95 ℃變性8 min，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，TBST漂洗后加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。12 h后TBST漂洗后加入二抗孵育1.5 h，TBST液避光漂洗后在紅外激光成像系統(tǒng)掃描，用SigmaScanPro 5軟件分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 對(duì)血清中ALT、AST水平的影響

與正常組比較，斑蝥素組ALT和AST水平均顯著升高(P<0.05)；給予人參皂苷Rb1提前干預(yù)過(guò)后，與斑蝥素組比較，ALT和AST水平均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，人參皂苷Rb1低劑量組比高劑量組干預(yù)效果更好，見(jiàn)圖1。

注：與正常組比較#P<0.05，##P<0.01；與斑蝥素組比較*P<0.05，**P<0.01。

2.2 對(duì)肝臟病理變化的影響

HE結(jié)果顯示，與正常組比較，斑蝥素組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝索絮亂，肝細(xì)胞輪廓模糊，呈輕微空泡樣變化；給予人參皂苷Rb1提前干預(yù)過(guò)后，其低劑量組能明顯改善肝組織受損情況，高劑量組肝索結(jié)構(gòu)有所改善，但伴有水腫現(xiàn)象。見(jiàn)圖2。

注：A.正常組；B.斑蝥素(0.56 mg/kg)組；C.人參皂苷Rb1 5 mg/kg組；D.人參皂苷Rb1 10 mg/kg組。

2.3 對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的影響

Western blot顯示，與正常對(duì)照組比較，給予斑蝥素組大鼠肝臟中蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK顯著上調(diào)(P<0.01)；給予人參皂苷Rb1提前干預(yù)過(guò)后，低劑量組均可顯著下調(diào)p-ERK、p-JNK、p-p38 MAPK的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，高劑量組顯著下調(diào)p-ERK、p-JNK蛋白的表達(dá)(P<0.01)，對(duì)p-p38 MAPK的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)肝臟MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化的影響

表1 人參皂苷Rb1對(duì)肝臟p-ERK，p- JNK，p-p38 MAPK相對(duì)表達(dá)的影響

3 討論

臨床研究表明斑蝥素是抗肝癌的有效成分，其治療量對(duì)肝臟有一定毒副作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予斑蝥素后，SD大鼠血清血AST及ALT水平均顯著升高；病理觀察見(jiàn)肝臟部分細(xì)胞核分裂、溶解、壞死，與已有研究一致[7，12-14]，確保了肝毒性建模成功。人參皂苷Rb1是人參的主要活性成分之一，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其可預(yù)防肝臟的缺血再灌注損傷，改善對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性肝毒性，抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化及肝臟脂肪沉淀[15]，降低血清ALT和AST水平，進(jìn)而減輕小鼠肝臟的功能和形態(tài)學(xué)損傷[16]，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1提前干預(yù)過(guò)后，可顯著改善斑蝥素AST及ALT水平及肝臟的病理變化，且人參皂苷Rb1低劑量組接近正常組水平，并改善動(dòng)物的生活質(zhì)量和提高動(dòng)物的存活率。人參皂苷Rb1低劑量組較高劑量組顯示更好的干預(yù)效果，是否高劑量的人參皂苷Rb1對(duì)肝臟有一定的影響，或在較高的劑量藥物之間也存在相互影響仍有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞生存依賴細(xì)胞能接受一定的胞外信號(hào)，通過(guò)細(xì)胞膜受體傳導(dǎo)入胞質(zhì)或經(jīng)一系列傳導(dǎo)系統(tǒng)入核調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和生長(zhǎng)[17]。真核細(xì)胞對(duì)外界條件的刺激反應(yīng)活性調(diào)節(jié)主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK，cJun-N氨基末端激酶JNK和絲裂原活化蛋白p38 MAPK三條并行的MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要與細(xì)胞的增殖、分化、存活和死亡密切相關(guān)[18]，在NCI-H46細(xì)胞中，斑蝥素抑制P-ERK、p-JNK、p-P38表達(dá)來(lái)阻礙細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖[19]。有研究報(bào)道[20]人參皂苷Rb1可通過(guò)激活p-ERK、p-p38MAPK表達(dá)發(fā)揮抗炎、抗凋亡，進(jìn)而對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用，通過(guò)調(diào)控MAPK信號(hào)通路下游炎癥因子NF-κB的磷酸化變化減輕對(duì)乙酰氨基酚對(duì)小鼠肝臟的毒性[16]，通過(guò)JNK信號(hào)通路下調(diào)IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)改善糖尿病大鼠肝損[21]。本研究也顯示，人參皂苷Rb1可通過(guò)上調(diào)斑蝥素對(duì)p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK蛋白的抑制作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)移位到核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)肝臟細(xì)胞的存活和增殖以及發(fā)揮抗凋亡作用保護(hù)肝臟。

綜上，適量的人參皂苷Rb1對(duì)斑蝥素介導(dǎo)的肝損傷有很好的保護(hù)作用，主要和上調(diào)MAPK相關(guān)蛋白ERK、JNK、P38MAPK有關(guān)，由于沒(méi)有用MAPK信號(hào)通路的抑制劑及探索和上下游的關(guān)系，其具體的機(jī)制有待研究。