符靜泉，韋曼莉，韋明中，趙凱麗，黃純瑩，蔣偉哲，付書婕

(1.南寧市衛(wèi)生學(xué)校，廣西 南寧 530007；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；3.賀州市人民醫(yī)院，廣西 賀州 542800)

高尿酸血癥是一種患病率極高的疾病，由體內(nèi)嘌呤代謝紊亂致血中尿酸水平異常升高所引起。高尿酸血癥是代謝性疾病，更是誘發(fā)痛風(fēng)的主要因素之一[1-2]。痛風(fēng)的確切病因與發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，治療手段主要為促進(jìn)尿酸排泄和抑制尿酸合成以緩解其病情發(fā)展，不良反應(yīng)較大，且胃腸道反應(yīng)明顯，患者常伴隨肝腎功能損害。中藥的不良反應(yīng)較少，價(jià)格低廉，因此開發(fā)抗高尿酸的中藥具有重要的價(jià)值[3-4]。

貓須草(Orthosiphon stamineus)，又名腎茶，為唇形科腎茶屬多年生草本植物，因形態(tài)上其雄蕊和花柱伸出花冠外酷似貓須而得名，是我國(guó)傣族民間常用草藥，傣族經(jīng)典醫(yī)學(xué)著作《貝葉經(jīng)》《檔哈雅》對(duì)其臨床應(yīng)用有詳細(xì)記載[5-6]。該屬植物全世界僅有5種，而我國(guó)唯有一種，主要分布于廣東、廣西南部、海南、臺(tái)灣、云南南部及福建等地[7]。目前，關(guān)于貓須草抗高尿酸血癥作用的研究報(bào)道較少，本研究分別注射次黃嘌呤溶液和灌胃氧嗪酸鉀鹽的方法建立兩種急性高尿酸血癥動(dòng)物模型，初步探討貓須草的降尿酸作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)KM小鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2014-0003。

1.1.2 藥物 貓須草(Clerodendranthusspicatus(Thunb.) C.Y.Wu ex H.W.Li)(南寧市生源中藥飲片有限責(zé)任公司，干燥保存)；別嘌醇片(廣東彼得藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130803)；次黃嘌呤(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)TM0313XC13)；氧嗪酸鉀鹽(德國(guó)Sigma公司，批號(hào)12042001)。

1.1.3 試劑的配制 (1)貓須草水提物的制備：貓須草干燥枝葉粉碎得粗粉，取250 g，加蒸餾水10倍量，100 ℃水浴鍋回流3次，每次進(jìn)行1 h，合并3次回流所得濾液，減壓濃縮至膏狀，80 ℃電熱恒溫干燥箱干燥[8-9]，得提取物粉末質(zhì)量為14.533 g，計(jì)算得率為5.81%；再將所得提取物按劑量用蒸餾水溶解即配制成灌胃給藥的貓須草水提物(OSE)。

(2)供試品溶液的配制：取貓須草水提取物5 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加入無(wú)水甲醇，定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得0.5 mg/mL供試品溶液。

(3)對(duì)照品溶液的配制：取咖啡酸對(duì)照品15 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加入無(wú)水甲醇，定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得1.478 mg/mL咖啡酸對(duì)照品溶液。取迷迭香酸對(duì)照品20 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶，加入無(wú)水甲醇，定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得1.95 mg/mL迷迭香酸對(duì)照品溶液。精密量取1 mL、1.478 mg/mL咖啡酸對(duì)照品溶液和1 mL、1.95 mg/mL迷迭香酸對(duì)照品溶液，置于25 mL容量瓶，加入無(wú)水甲醇，定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得咖啡酸與迷迭香酸混合對(duì)照品溶液(咖啡酸濃度為0.059 15 mg/mL，迷迭香酸濃度為0.078 mg/mL)。

1.1.4 儀器 萬(wàn)分之一天子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號(hào)：EL204型)；百分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，型號(hào)：EL602型)；恒溫水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，型號(hào)：WB-2000)；高速低溫離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)：Micro CL17R)；全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI日立集團(tuán)，型號(hào)：日立7100)；無(wú)菌操作臺(tái)(長(zhǎng)沙米淇?jī)x器設(shè)備有限公司，型號(hào)：1334)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；粉碎機(jī)(上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 120只KM小鼠按性別、體質(zhì)量使用Excel軟件區(qū)組分層隨機(jī)分組法隨機(jī)分為12組，每組10只，次黃嘌呤組小鼠和氧嗪酸鉀鹽組小鼠各60只，分別為空白組，模型組，OSE高、中、低劑量組，別嘌醇組。次黃嘌呤組小鼠第7天灌胃給藥后1 h，除空白組腹腔注射等體積生理鹽水外，模型組與各給藥組小鼠腹腔注射次黃嘌呤溶液(50 mg/mL)10 mL/kg，同時(shí)撤去飼料，禁食不禁水；氧嗪酸鉀鹽組小鼠給藥的7 d內(nèi)，每日上午9時(shí)分別灌胃給予模型組及各給藥組氧嗪酸鉀鹽(250 mg/kg)。

1.2.2 給藥方法 每日上午10時(shí)灌胃1次，每次給藥10 mL/kg。經(jīng)查閱文獻(xiàn)及中醫(yī)處方，并由體表面積換算，設(shè)高、中、低給藥劑量分別為3 000 mg/kg、1 500 mg/kg、750 mg/kg?？瞻捉M和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，別嘌醇組以別嘌醇藥液(5 mg/kg)灌胃給藥。OSE高、中、低劑量組分別用OSE藥液灌胃給藥，連續(xù)灌胃7 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 (1)貓須草水提取物中咖啡酸與迷迭香酸的檢測(cè)：色譜柱：Kinetex? C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；以乙腈-0.1 %磷酸水溶液(15∶85)為流動(dòng)相；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm；圖譜采集時(shí)間為80 min。理論塔板數(shù)以咖啡酸和迷迭香酸計(jì)算均不低于3 000，分離度均大于1.5。

(2)指標(biāo)測(cè)定：次黃嘌呤組造模后半個(gè)小時(shí)，去眼球采血；氧嗪酸鉀鹽組第7天給藥后1 h，去眼球采血(采血前12 h禁食不禁水)1.0 mL～1.5 mL，常溫靜置1 h后，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清，于HITACHI7100生化分析儀測(cè)定血清尿酸(SUA)、血清肌酐(SCr)和血清尿素氮(BUN)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 含量測(cè)定結(jié)果

由圖1和圖2可見對(duì)照品及供試品色譜圖，采用外標(biāo)法對(duì)OSE主要成分中的咖啡酸及迷迭香酸進(jìn)行含量測(cè)定?？芍Х人釋?duì)照品峰面積(A1)為1 027.756 10，咖啡酸樣品峰面積(A2)為1 259.717 96，迷迭香酸對(duì)照品峰面積(A3)為2 902.996 02，迷迭香酸樣品峰面積(A4)為2 771.667 36?？Х人釋?duì)照品濃度(C1)為0.059 15 mg/mL，迷迭香酸對(duì)照品濃度(C3)為0.078 mg/mL。由此計(jì)算咖啡酸樣品濃度C2為0.072 5 mg/mL，迷迭香酸樣品濃度C4為0.074 5 mg/mL。換算為貓須草生藥含量為：樣品中咖啡酸的生藥含量為8.424 5 mg/g；樣品中迷迭香酸的生藥含量為8.645 69 mg/g。

圖1 咖啡酸與迷迭香酸對(duì)照品混合溶液HPLC色譜

圖2 貓須草水提溶液HPLC色譜

由表1可見，與空白組比較，模型組SUA、SCr和BUN水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)造模成功，實(shí)驗(yàn)具有可靠性。與模型組相比，別嘌醇組能大幅度降低USA、SCr和BUN含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明別嘌醇對(duì)次黃嘌呤致小鼠急性高尿酸血癥具有干預(yù)作用。OSE高、中劑量組不同程度地降低USA、SCr和BUN含量，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，其中高劑量組與空白組最為接近，其效果最明顯。

表1 OSE對(duì)次黃嘌呤致急性高尿酸血癥小鼠血清SUA、SCr和BUN水平的影響

2.2 OSE對(duì)氧嗪酸鉀鹽致小鼠急性高尿酸血癥的作用

由表2可見，與空白組比較，模型組SUA、SCr和BUN水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組相比，別嘌醇組能大幅度降低SUA、SCr和BUN含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明別嘌醇對(duì)氧嗪酸鉀鹽致小鼠高尿酸血癥具有干預(yù)作用。OSE高劑量組降低SUA、SCr和BUN含量，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；但OSE中和低劑量組對(duì)SUA的作用不明顯(P>0.05)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 OSE對(duì)氧嗪酸鉀鹽致急性高尿酸血癥小鼠血清SUA、SCr和BUN水平的影響

3 討論

高尿酸血癥是痛風(fēng)的病理基礎(chǔ)，當(dāng)體內(nèi)尿酸達(dá)到一定濃度就會(huì)形成尿酸鹽沉積到腎臟和關(guān)節(jié)中，形成痛風(fēng)。研究高尿酸血癥的意義在于研究治療痛風(fēng)藥物的作用機(jī)制[10]。次黃嘌呤是尿酸的前體物質(zhì)，能被黃嘌呤氧化酶催化為尿酸，目前已經(jīng)廣泛用于急性高尿酸血癥的模型建立。本實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠腹腔注射次黃嘌呤建立急性高尿酸血癥模型，其優(yōu)點(diǎn)在于一次給藥即可使模型小鼠SUA濃度持續(xù)升高較長(zhǎng)時(shí)間，已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，腹腔注射500 mg/kg的劑量進(jìn)行急性高尿酸血癥模型的建立具有SUA水平升高迅速、維持時(shí)間長(zhǎng)、器官損傷小等特點(diǎn)[11]。結(jié)果顯示模型組SUA水平顯著升高，提示模型復(fù)制成功。別嘌醇雖然能大幅度降低小鼠SUA，但SUA水平低于空白組，表明副作用比較大。OSE高、中劑量組均能顯著降低急性高尿酸血癥小鼠SUA，說(shuō)明OSE對(duì)治療痛風(fēng)疾病具有良好的效果，且安全性能高。

尿酸氧化酶能使尿酸迅速氧化催化成為過(guò)氧化氫及尿囊酸等物質(zhì)，不再被腎小管吸收而排出體外。氧嗪酸鉀鹽作為尿酸氧化酶抑制劑，能抑制尿酸分解，從而升高體內(nèi)尿酸水平[12]。本實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠連續(xù)7d灌胃給予氧嗪酸鉀鹽的方法建立急性高尿酸血癥模型，結(jié)果SUA顯著升高，提示模型復(fù)制成功。別嘌醇組和OSE高劑量組能顯著降低急性高尿酸血癥小鼠SUA，說(shuō)明OSE高劑量組對(duì)治療高尿酸血癥具有良好的效果。

據(jù)國(guó)內(nèi)外研究，貓須草已分離鑒定出200多種化學(xué)成分，主要包括黃酮類、酚類、二萜類、三萜類、精油等成分[13]，而其抗氧化、利尿、抗炎和抗慢性腎衰竭等藥理作用與其所含迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸、黃酮類、肌酐等有關(guān)。咖啡酸具有極強(qiáng)的抗氧化能力和DPPH氧自由基清除能力[14]。迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、降尿酸和抑制黃嘌呤氧化酶等作用[15-18]。因此，OSE的降尿酸機(jī)制可能與其主要成分咖啡酸、迷迭香酸的抗炎和抑制黃嘌呤氧化酶作用有關(guān)，本課題組在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步探索OSE的有效成分及降低高尿酸血癥尿酸水平的作用機(jī)制。