馬崢玲，譚子虎,2△，尹茜茜，莊詩(shī)瑤，徐樂(lè)樂(lè)

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(AD)是最常見(jiàn)的癡呆類型，據(jù)估計(jì)2050年全球癡呆患者人數(shù)將達(dá)1.15億，其中約2/3為AD患者[1]。其患病群體龐大、醫(yī)療護(hù)理繁雜，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。如何實(shí)現(xiàn)有效的神經(jīng)再生，改善認(rèn)知，提高患者及其家屬生活質(zhì)量，是AD治療面臨的主要挑戰(zhàn)[2]。中醫(yī)論治癡呆歷史久遠(yuǎn)且臨床行之有效，以整體調(diào)節(jié)、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)被廣泛關(guān)注[3]。

AD在中醫(yī)學(xué)中屬“癡呆”范疇，病機(jī)總歸脾腎虧虛，無(wú)以充養(yǎng)髓海，加之痰瘀阻竅，漸至髓減腦消，發(fā)為本病。薯蕷丸源于《金匱要略》，乃仲景“虛勞風(fēng)氣百疾”之代表方，具有氣血同調(diào)、散收相因、功專理脾的特點(diǎn)[4]。本方由湖北省中醫(yī)院名老中醫(yī)呂繼端教授結(jié)合臨證經(jīng)驗(yàn)，去其祛風(fēng)之性，酌加滋腎化瘀之品，加減用于臨床，取得較好療效。前期研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸能有效改善AD患者認(rèn)知功能和日常生活能力[5]，說(shuō)明加減薯蕷丸對(duì)AD的潛在療效，具有廣泛的研究空間。為挖掘加減薯蕷丸對(duì)AD的潛在作用機(jī)制，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)加減薯蕷丸干預(yù)AD可能的分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)關(guān)鍵藥物成分及靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為后期進(jìn)一步研究加減薯蕷丸干預(yù)AD作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php)檢索各中藥的化學(xué)成分，依據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢所有活性成分靶標(biāo)蛋白，經(jīng)Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)校正確定已驗(yàn)證人源基因名稱。對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中未查詢到靶標(biāo)蛋白的活性成分，利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集其結(jié)構(gòu)信息，經(jīng) SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，取可信度高的靶點(diǎn)。最后將通過(guò)上述方法收集到的加減薯蕷丸藥物活性化學(xué)成分與靶點(diǎn)進(jìn)行匯總。

1.2檢索AD疾病靶點(diǎn) 基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)，以“Alzheimer disease”為搜索詞，檢索與疾病相關(guān)的作用靶點(diǎn)，將檢索得到的疾病靶點(diǎn)匯總?cè)ブ亍?/p>

1.3獲取加減薯蕷丸治療AD潛在靶點(diǎn) 將AD疾病基因與加減薯蕷丸作用靶點(diǎn)取交集，獲取共同靶點(diǎn)，即為加減薯蕷丸作用于AD的潛在作用靶點(diǎn)。然后通過(guò)Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建加減薯蕷丸治療AD的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行分析。

1.4構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.6.1軟件分析PPI結(jié)果，依據(jù)度值、介度值、中心度值等拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果篩選出核心網(wǎng)絡(luò)。

1.5基因本體(GO)功能富集分析和基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/gp/index.html)對(duì)交集基因行GO功能、KEGG通路富集分析。所得結(jié)果中活性成分靶點(diǎn)基因更集中的通路，被認(rèn)為是加減薯蕷丸治療AD的重要調(diào)節(jié)通路。

1.6分子對(duì)接 運(yùn)用AutoDockVina 1.5.6將加減薯蕷丸方中的關(guān)鍵化學(xué)成分和潛在作用靶點(diǎn)中度值排名前5的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接試驗(yàn)。使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心化合物sdf結(jié)構(gòu)文件，導(dǎo)入Chem 3D軟件調(diào)整化合物空間構(gòu)想，保存為“mol 2”格式，經(jīng)AutoDockVina 1.5.6分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式。

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)的3D晶體結(jié)構(gòu)，使用PyMol軟件去除靶蛋白水分子，分離原始配體和受體后導(dǎo)入AutoDockVina 1.5.6，加氫、分配電荷、添加原子類型后保存為“pdbqt”格式。使用AutoDockVina 1.5.6進(jìn)行分子對(duì)接，計(jì)算結(jié)合能大小。

2 結(jié) 果

2.1加減薯蕷丸活性化學(xué)成分篩選 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出加減薯蕷丸各味中藥符合條件的活性化學(xué)成分，其中白芍14個(gè)，白術(shù)7個(gè)，川芎7個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，黨參21個(gè)，茯苓15個(gè)，枸杞子45個(gè)，山藥16個(gè)，石菖蒲4個(gè)，熟地2個(gè)，五味子8個(gè)，匯總?cè)ブ睾蠊搏@得103個(gè)活性成分。經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)均一化獲得藥物靶點(diǎn)，去重后共獲得536個(gè)候選靶點(diǎn)。

2.2藥物-疾病交集靶點(diǎn)篩選 以“Alzheimer disease”為搜索詞，檢索GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選與疾病相關(guān)且可信度高的作用靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ睾蠊搏@得1 966個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.3中藥活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心化合物分析 將2.1中篩選得到的536個(gè)候選作用靶點(diǎn)與AD疾病基因取交集，得到243個(gè)交集靶點(diǎn)，即加減薯蕷丸作用于AD的潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)潛在靶點(diǎn)反向推導(dǎo)，得出藥物作用于AD的化合物共82個(gè)，使用Cytoscape 3.6.1軟件將82個(gè)化合物及243個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，構(gòu)建中藥活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)最多的前10個(gè)關(guān)鍵成分，依次為槲皮素、豬苓酸C、齒孔酸等，度值為19～100，具體見(jiàn)表1。故推測(cè)這些成分為加減薯蕷丸治療AD關(guān)鍵活性成分。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將243個(gè)潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)即可得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，文件以“tsv”格式保存。保存的“tsv”文件上傳至Cytoscape 3.6.1軟件，先以度值大于2倍中位數(shù)初次篩選網(wǎng)絡(luò)，再以網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)介度值(中位數(shù)為4.837)、中心度值(中位數(shù)為0.902)、度值(中位數(shù)為97)等參數(shù)大于中位數(shù)篩選得到核心靶點(diǎn)22個(gè)(圖1)。其中MAPK3、AKT1、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、VEGFA為度值排名前五的靶點(diǎn)基因。

2.5GO功能和KEGG通路富集分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)將取得的交集基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能分析包括生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能3個(gè)水平，分別選取富集程度最高的前10個(gè)。在生物過(guò)程中，靶點(diǎn)主要涉及對(duì)氮化物的反應(yīng)(cellular response to nitrogen compound)、炎癥應(yīng)答(inflammatory response)及創(chuàng)傷反應(yīng)(response to wounding)。在細(xì)胞組成中，靶點(diǎn)主要涉及膜閥(membrane raft)、樹(shù)突(dendrite)、突觸后膜(postsynapse)等。分子功能主要涉及G蛋白耦連胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白激酶連接(kinase binding)等。見(jiàn)圖2。

圖2 GO功能富集分析結(jié)果圖

KEGG通路富集分析選取富集程度最高的前20條通路，交集靶點(diǎn)主要富集于癌癥通路、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)-RAGE信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路、麻疹通路、cAMP信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等，提示上述通路與加減薯蕷丸干預(yù)AD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。見(jiàn)圖3。

圖3 KEGG通路富集分析結(jié)果圖

2.6分子對(duì)接驗(yàn)證 依據(jù)2.3中篩選出的藥物干預(yù)AD的關(guān)鍵活性成分與2.4中度值排名前五的靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。當(dāng)結(jié)合能小于0時(shí)，認(rèn)為關(guān)鍵活性成分與靶蛋白可自由結(jié)合，且結(jié)合自由能越低，二者結(jié)合能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，主要成分與靶蛋白結(jié)合活性均較高。表明10種化合物均與靶蛋白受體間具有較佳的結(jié)合效能。見(jiàn)圖4。

圖4 加減薯蕷丸核心化合物與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能熱圖

3 討 論

加減薯蕷丸始于《金匱要略》，由呂繼端教授根據(jù)癡呆“脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)”之病機(jī)加減而成。方中山藥、熟地、枸杞子、五味子健脾補(bǔ)腎、填精益髓，以資先天；黨參、白術(shù)、茯苓益氣健脾、化痰祛濕，以實(shí)中土；當(dāng)歸、川芎養(yǎng)血活血，以祛瘀開(kāi)竅；白芍?jǐn)筷幦岣我宰剃幰翰蛔?。諸藥為伍，水土合補(bǔ)，痰瘀得除，從而延緩疾病進(jìn)展。

從加減薯蕷丸活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及分子對(duì)接結(jié)果中分析可知，2.3中篩選出的化合物可能為加減薯蕷丸干預(yù)AD的關(guān)鍵活性成分。槲皮素為一種黃酮醇，其神經(jīng)保護(hù)作用在許多體內(nèi)外試驗(yàn)中得到證實(shí)。其可通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗炎[6]、消除谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性[7]、抑制膽堿酯酶活性[8]、誘導(dǎo)自噬拮抗Aβ1-42介導(dǎo)的神經(jīng)毒性[9]等途徑減輕AD癥狀。β-谷甾醇為白芍、當(dāng)歸、枸杞子共有成分，可通過(guò)血-腦屏障在腦中積累，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等生物學(xué)活性[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可顯著降低APP/PS1小鼠Aβ40和Aβ42沉積、抑制BACE1的表達(dá)，增加樹(shù)突棘密度，改善APP/PS1小鼠行為學(xué)表現(xiàn)[11]。豆甾醇作為一種類固醇衍生物，易通過(guò)血-腦屏障，因其雙鍵結(jié)構(gòu)易被氧化，可作為有效的抗過(guò)氧化劑，且豆甾醇可激活Erk-Creb信號(hào)，誘導(dǎo)突觸發(fā)生和增強(qiáng)突觸可塑性，改善記憶損傷，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[12]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，與AD相關(guān)的前三名通路分別為AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路。AGE-RAGE信號(hào)通路在AD、糖尿病及其他年齡相關(guān)性疾病中破壞性影響十分突出[13]。研究發(fā)現(xiàn)，AGEs可直接或通過(guò)作用其受體RAGE激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α，且RAGE受體活化后可進(jìn)一步激活ROS相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激[14]，影響學(xué)習(xí)記憶功能。近年來(lái)，糖尿病腦病與 AD相關(guān)的說(shuō)法逐漸被關(guān)注，而胰島素受體底物的主要下游途徑之一便是PI3K/AKT級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。PI3K/AKT信號(hào)通路是控制細(xì)胞存活、代謝、生長(zhǎng)、分化的重要調(diào)控通路，在信號(hào)通路間的通信過(guò)程中起承轉(zhuǎn)作用。其對(duì)AD的作用不是單向的，一方面過(guò)度激活的PI3K/AKT通路在AD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，致神經(jīng)元過(guò)度活躍，傳遞錯(cuò)誤信號(hào)，產(chǎn)生損傷，且抑制自噬對(duì)Aβ的清除作用，減少斑塊清除[16]；另一方面，有研究者在AD動(dòng)物模型中觀察到PI3K/AKT信號(hào)通路被明顯抑制[17]，激活該信號(hào)通路可調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生、提高AD模型鼠認(rèn)知能力[17]。cAMP信號(hào)通路作為廣為人知的可調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)及記憶功能的第二信使[18],其不僅能調(diào)節(jié)興奮性谷氨酰胺能和膽堿能突觸的可塑性，還可作用于突觸后膜的γ-氨基丁酸受體，抑制GABA能神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用，從而提高學(xué)習(xí)和記憶能力[19]。

PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的核心靶點(diǎn)中，TNF與加減薯蕷丸各主要作用成分結(jié)合較其他靶點(diǎn)更緊密。TNF已被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要功能，包括損傷介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活、血-腦屏障滲透性調(diào)節(jié)、谷氨酰胺的傳遞、突觸可塑性及突觸縮放的調(diào)節(jié)等[20]。有研究者在死亡AD患者大腦中發(fā)現(xiàn)淀粉樣斑塊周圍區(qū)域TNF水平升高[21],且外周血清TNF水平升高與AD疾病進(jìn)展有關(guān)[22]。已有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證加減薯蕷丸可提高AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與海馬TNF-α表達(dá)被抑制相關(guān)[23]，進(jìn)一步說(shuō)明篩選結(jié)果的可靠性。

綜上所述，加減薯蕷丸可能通過(guò)槲皮素、豬苓酸C、齒孔酸、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等活性成分，作用于MAPK3、AKT1、TNF、IL-6、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、NF-κB等信號(hào)通路，發(fā)揮抗感染、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)突觸可塑性、調(diào)控細(xì)胞凋亡等作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥干預(yù)疾病多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

AD是一種復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病與突觸可塑性改變、特定神經(jīng)遞質(zhì)減少、鈣超載、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元死亡等相關(guān)。使用單體成分對(duì)其治療作用有限，并伴有明顯賴藥性及顯著不良反應(yīng)。而整體調(diào)節(jié)、多藥兼容為中醫(yī)治療的特色與精髓。加減薯蕷丸干預(yù)AD的臨床效果已得到有效驗(yàn)證。但由于配方化學(xué)成分的復(fù)雜性，其作用機(jī)制尚未得到明確解釋。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接等技術(shù)手段，通過(guò)全面系統(tǒng)地闡明加減薯蕷丸干預(yù)AD的神經(jīng)保護(hù)作用潛在分子機(jī)制，為探索加減薯蕷丸藥理作用提供了參考。