李彥辰，鄒 露，熊福龍，戴世溧，張 昊，周 亮

(蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥理系，江蘇 蘇州 215123)

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，多發(fā)性骨髓瘤(MM)占腫瘤疾病的1%，是第二常見的惡性血液腫瘤，發(fā)病率為每年4.5例/10萬(wàn)人～6.0例/10萬(wàn)人。1990—2016年，由于人口增長(zhǎng)、世界人口老齡化使得全球MM的發(fā)病率增長(zhǎng)了1.26倍[1]。 MM難治愈、易復(fù)發(fā)，這使了解MM發(fā)病機(jī)制并研發(fā)相應(yīng)藥物成了目前的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Btz)是首個(gè)批準(zhǔn)治療MM的藥物。作為一種緩慢可逆的抑制劑，Btz與26S蛋白酶體的催化位點(diǎn)結(jié)合，抑制β5亞基(糜蛋白酶樣活性)、β2亞基(胰蛋白酶樣活性)和β1 亞基(半胱氨酸蛋白酶樣活性)，導(dǎo)致蛋白的降解失衡從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-3]。但單一Btz用藥容易出現(xiàn)耐藥性，使得研發(fā)聯(lián)合用藥新策略成為目前研究的熱點(diǎn)。已有研究表明，Btz聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)藥物來(lái)那度胺和組蛋白去乙?；缸钄鄤┡帘人舅?Panobinostat)，可很好地抑制MM細(xì)胞增殖，從而改善MM的臨床療效和預(yù)后[4]。

已有激酶抑制劑被應(yīng)用于臨床上治療腫瘤，例如PI3K激酶抑制劑LY-317615正被用于治療復(fù)發(fā)性或難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤[5]。但迄今為止，還沒有激酶抑制劑被批準(zhǔn)用于MM治療。已有研究表明，TK抑制劑GSK1838705A、FAK/PYK2抑制劑VS-4718和VS-6062，以及p38抑制劑BIRB 796均可抑制MM細(xì)胞增殖[6-9]。另外，研究表明p38選擇性抑制劑SCIO-469和一種口服BTK抑制劑CC292，可以增強(qiáng)MM細(xì)胞Btz敏感性[10-13]，但是其內(nèi)在作用機(jī)制還不是很清楚。caspase信號(hào)通路激活能夠促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡，抑制其增殖[14]。另外，caspase非依賴的凋亡通路在MM細(xì)胞凋亡中也有相關(guān)報(bào)道。例如，GSK1838705A能夠通過抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體和相關(guān)激酶而不是caspase，抑制MM細(xì)胞增殖，促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡[6]。本研究中，作者利用了糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)抑制劑TWS119，發(fā)現(xiàn)TWS119抑制MM細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 GSK-3β抑制劑TWS119和蛋白酶體抑制劑Btz購(gòu)于Selleck公司；caspase抑制劑z-VAD-fmk購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；Calpain抑制劑Calpeptin購(gòu)于Santa Cruz公司；MM細(xì)胞系MM1.S和LP1購(gòu)于BNCC公司；細(xì)胞培養(yǎng)使用胎牛血清(FBS)和1640培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司；0.25% 胰蛋白酶和青霉素/鏈霉素(100×)購(gòu)于新賽美生物科技有限公司；MM細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)于NEST公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于Thermo Scientific公司； anti-PARP1抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司； anti-GAPDH抗體購(gòu)于Proteintech公司；辣根過氧化物偶聯(lián)的二抗購(gòu)于Jackson 免疫研究實(shí)驗(yàn)室。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 LP1和MM1.S細(xì)胞使用1640培養(yǎng)基(10% FBS,1%青霉素/鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3天進(jìn)行細(xì)胞傳代。用于免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞接種在24孔板中，接著使用相應(yīng)藥物處理后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)WB實(shí)驗(yàn)。用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞接種在96孔板中，接著使用相應(yīng)藥物處理后，利用CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒測(cè)量細(xì)胞增殖情況。

1.2.2WB實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞使用RIPA裂解緩沖液[150 mmol/L Nacl、1% 聚乙二辛基苯基醚(TritonX-100)、0.1% SDS、50 mmol/L Tris-base(pH 7.4)、 1mmol/L EDTA]裂解后，超聲破碎，添加5倍聚丙烯酰胺凝脈電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液[250 mmol/L Tris-HCL(pH 6.8)、10% SDS、0.25% 溴酚藍(lán)(BPB)、50% 甘油、5% β-巰基乙醇]，98 ℃處理5～10 min。利用10% 蛋白膠進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，分離蛋白。轉(zhuǎn)膜后，利用10%脫脂牛奶(3 g脫脂奶粉、30 mL 1倍TBST緩沖液)封閉1 h，接著孵育相應(yīng)一抗和二抗。最后采用凝膠成像系統(tǒng)Tanon 5200儀器采集圖片。

1.2.3CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 具體步驟參考CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒說明書。在96孔板上接種MM細(xì)胞，接種密度為每孔1 000個(gè)細(xì)胞/200 μL培養(yǎng)基。接著使用相關(guān)藥物處理，培養(yǎng)指定時(shí)間后，加入20 μL的CCK-8溶液(5 mg/mL)。接著繼續(xù)培養(yǎng)2 h，最后使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(450 nm)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3～4次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4具體操作 (1)首先使用TWS119處理LP1和MM1.S 24 h后，收集細(xì)胞，并且進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)。作者使用經(jīng)典的凋亡信號(hào)分子人聚(ADP核糖)聚合酶1(PARP1)來(lái)考察MM細(xì)胞凋亡。同時(shí)，為了研究MM細(xì)胞增殖情況，使用TWS119處理LP1和MM1.S細(xì)胞6 d，運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。(2)已有研究表明，10 μmol/L z-VAD-fmk處理細(xì)胞24 h就能夠比較好地阻斷細(xì)胞內(nèi)caspase信號(hào)通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[15-16]，同時(shí)10 μmol/L TWS119處理24 h能夠比較好地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]?；诖?，本研究采用10 μmol/L z-VAD-fmk預(yù)處理LP1細(xì)胞30 min，接著使用10 μmol/L TWS119處理LP1細(xì)胞24 h，利用WB實(shí)驗(yàn)及CCK-8試劑盒檢測(cè)LP1細(xì)胞凋亡、增殖。(3)為進(jìn)一步證明，利用蛋白酶體抑制劑Btz來(lái)誘導(dǎo)LP1細(xì)胞凋亡。采用10 μmol/L z-VAD-fmk預(yù)處理LP1細(xì)胞30 min，接著使用10 μmol/L Btz處理LP1細(xì)胞24 h，利用WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LP1細(xì)胞凋亡。另外，已有研究表明蛋白水解酶Calpain能夠切割PARP1[18]，本研究利用Calpain抑制劑Calpeptin(10 μmol/L)來(lái)預(yù)處理LP1細(xì)胞，進(jìn)而使用10 μmol/L TWS119處理LP1細(xì)胞24 h，利用WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LP1細(xì)胞凋亡。(4)本研究進(jìn)一步研究了TWS119和Btz在人源MM中聯(lián)合用藥的效果。通過聯(lián)合10 μmol/L TWS119和10 μmol/L Btz處理LP1細(xì)胞24 h，利用WB實(shí)驗(yàn)及CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡和增殖。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism Version 6.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TWS119對(duì)MM細(xì)胞凋亡及增殖影響 TWS119分別處理LP1和MM1.S細(xì)胞24 h、6 d后，顯著誘導(dǎo)LP1和MM1.S中PARP1切割(圖1A、C)，即誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；顯著抑制LP1和MM1.S細(xì)胞增殖(圖1B、D)。與對(duì)照組[二甲基亞砜(DMSO)]比較，TWS119促進(jìn)LP1和MM1.S細(xì)胞凋亡及抑制LP1和MM1.S細(xì)胞增殖均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2TWS119通過caspase非依賴方式影響MM細(xì)胞凋亡及增殖 caspase抑制劑z-VAD-fmk不能抑制TWS119誘導(dǎo)的LP1細(xì)胞凋亡(圖2A)，即TWS119誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡是通過caspase非依賴方式。 另外，caspase抑制劑z-VAD-fmk也不能緩解TWS119對(duì)LP1細(xì)胞增殖的抑制作用(圖2B)，即TWS119抑制MM細(xì)胞增殖是通過caspase非依賴方式。caspase抑制劑z-VAD-fmk能夠顯著抑制Btz誘導(dǎo)的LP1細(xì)胞凋亡(圖2C)。與z-VAD-fmk、Btz比較，TWS119促進(jìn)LP1細(xì)胞凋亡及抑制LP1細(xì)胞增殖均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，Calpain抑制劑Calpeptin不能抑制TWS119誘導(dǎo)的LP1細(xì)胞凋亡(圖2D)，即TWS119誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡是通過caspase和Calpeptin非依賴方式。與Calpeptin比較，TWS119促進(jìn)LP1細(xì)胞凋亡及抑制LP1細(xì)胞增殖均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

A、C.LP1、MM1.S細(xì)胞使用TWS119處理24 h后，進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡；B、D.LP1和MM1.S細(xì)胞使用TWS119處理6 d后，進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖；TWS119與DMSO比較，a P<0.05。

A、B.caspase抑制劑z-VAD-fmk預(yù)處理LP1細(xì)胞，接著使用TWS119進(jìn)行處理，行WB、CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡和增殖；C.caspase抑制劑z-VAD-fmk預(yù)處理LP1細(xì)胞，接著使用Btz進(jìn)行處理，行WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡；D.Calpain預(yù)處理LP1細(xì)胞，接著使用TWS119進(jìn)行處理，行WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡；聯(lián)合Btz和z-VAD-fmk與單獨(dú)Btz比較，a P<0.05；聯(lián)合TWS119和z-VAD-fmk或Calpeptin與單獨(dú)TWS119比較，b P>0.05。

2.3TWS119增加MM細(xì)胞Btz敏感性 聯(lián)合用藥在促進(jìn)LP1細(xì)胞凋亡方面具有最明顯的效果(圖3A)，TWS119能夠顯著增加Btz誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。聯(lián)合10 μmol/L TWS119和2 μmol/L Btz能夠顯著抑制LP1細(xì)胞增殖(圖3B)，TWS119能夠顯著增強(qiáng)Btz對(duì)MM細(xì)胞增殖的抑制作用。與Btz比較，TWS119增加Btz誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)Btz對(duì)MM細(xì)胞增殖差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

A、B.LP1細(xì)胞使用TWS119和(或)Btz處理后，行WB、CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡和增殖；聯(lián)合TWS119和Btz與單獨(dú)TWS119和單獨(dú)Btz比較，a P<0.05。

3 討 論

本研究中，作者利用蛋白PARP1切割來(lái)證明MM細(xì)胞凋亡，在2種人源MM細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GSK-3β小分子抑制劑TWS119能夠促進(jìn)MM細(xì)胞的凋亡。同時(shí)利用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒發(fā)現(xiàn)TWS119能夠顯著抑制2種MM細(xì)胞的增殖。最后，聯(lián)合TWS119和臨床上用于治療MM的藥物Btz處理MM細(xì)胞，證明TWS119能夠顯著增加MM細(xì)胞Btz敏感性。

分子機(jī)制上已有研究表明，誘導(dǎo)caspase激活能夠促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡并且抑制其增殖[14]。 因此，作者考慮了caspase通路在TWS119殺傷MM細(xì)胞中的作用。但本研究發(fā)現(xiàn)，caspase抑制劑z-VAD-fmk能夠顯著抑制Btz的毒性，但是并不能夠抑制TWS119在MM細(xì)胞中的毒性。這說明TWS119不是通過激活caspase通路來(lái)抑制MM細(xì)胞增殖，促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡。已有研究表明，通過穩(wěn)定p53和抑制STAT3信號(hào)通路也能夠誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞周期停滯和凋亡[19]。

caspase的激活能夠切割PARP1，同時(shí)已有研究表明，Calpain和Cathepsin等蛋白酶也能夠切割PARP1，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡[20]。這些caspase非依賴的PARP1切割和凋亡，是否參與了TWS119在MM細(xì)胞中的毒性作用，針對(duì)這一問題，作者利用Calpain抑制劑Calpeptin預(yù)處理LP1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Calpeptin也不能抑制TWS119誘導(dǎo)的PARP1切割，這說明TWS119誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不依賴于Calpain通路?？梢?，本研究證明了TWS119誘導(dǎo)的MM細(xì)胞凋亡不依賴于經(jīng)典的caspase和Calpain通路，其內(nèi)在的具體通路還需要進(jìn)一步研究。

Btz能夠明顯促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡，抑制其增殖，從而被臨床應(yīng)用于治療MM，但單一Btz用藥容易產(chǎn)生耐藥性。研究表明，長(zhǎng)期Btz處理可能影響B(tài)tz與PSMB5的結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥性[21]。另外，也有文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)期單一使用Btz所產(chǎn)生的耐藥性也與絲氨酸的合成增加有關(guān)[22]。如何增加Btz敏感性，是目前基于Btz治療中亟待解決的問題。本研究中，作者聯(lián)合TWS119和Btz處理MM細(xì)胞，對(duì)比單一TWS119和Btz用藥，聯(lián)合TWS119和Btz用藥在促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡和抑制其增殖方面效果最為明顯。這說明TWS119能夠增加MM細(xì)胞Btz敏感性。Btz誘導(dǎo)的MM細(xì)胞毒性依賴于caspase通路，而TWS119誘導(dǎo)的MM細(xì)胞毒性不依賴于caspase通路，這使得在MM細(xì)胞中聯(lián)合Btz和TWS119用藥，能夠通過caspase依賴和非依賴的方式促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡，并且抑制其增殖。本研究為二者聯(lián)合用藥提供了一定的理論基礎(chǔ)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β小分子抑制劑TWS119可促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。同時(shí)也證明了TWS119能夠顯著增加MM細(xì)胞Btz敏感性。聯(lián)合TWS119和Btz處理MM細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為MM疾病治療提供了新思路和新策略。