林永盛，桑潔麗，邱子文，尹冠文，林曉潔，吳少華,2，李永裕,2，楊 超,2*

1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院；2福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院植物天然產(chǎn)物研究所，福州 350002

近年來，由于土壤鹽漬化的問題日益嚴重，導(dǎo)致土壤中存在過量的Na+或Clˉ。全球20%以上的耕地受到鹽脅迫的影響[1]。土壤鹽漬化會對植物種子的萌發(fā)和生長，植株的光合作用、離子平衡和養(yǎng)分平衡等造成影響，從而導(dǎo)致植株無法正常生長[2]。因此，種植耐鹽植物不僅是改善鹽堿地生態(tài)環(huán)境的有效途徑之一，且能促進畜牧業(yè)發(fā)展，提高鹽堿地的經(jīng)濟效益[3]。Yao等[4]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的復(fù)合鹽配方可提高羅勒(OcimumbasilicumL.)的精油產(chǎn)量，但對其中6種主要精油成分沒有顯著影響。Feng等[5]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫雖然會導(dǎo)致紫枝玫瑰(RosarugosaThunb)精油中香氣成分的含量降低，但會使精油中的香氣成分增多?？梢姡m當(dāng)?shù)柠}脅迫處理會對芳香植物的精油含量和精油成分造成不同程度的影響。

千層金(MelaleucabracteataF.Muell.)屬于桃金娘科白千層屬常綠喬木，不僅具有較為廣泛的生存適應(yīng)性，抗旱且耐鹽堿，種植范圍可從海南省到長江流域以南甚至更北的地區(qū)，還具備較高觀賞價值，常作為沿海地區(qū)城市道路綠化使用[6,7]，千層金葉片中富含植物精油，香氣濃郁，主要成分有醚類、酯類、烴類、酚類、醇類、醛類等，含量最高的成分為甲基丁香酚，精油活性顯著[8]，具有殺螨活性和引誘實蠅屬昆蟲的功能[9]，且對狄克氏菌、金黃色葡萄球菌、假單胞菌等七種病原菌均有明顯的抑制作用[10]。目前，國內(nèi)外關(guān)于千層金鹽堿脅迫、扦插育苗、水分脅迫等方面已有相關(guān)研究。Dunn等[11]在澳大利亞昆士蘭東南部的鹽堿地中探究了12種樹種的種植表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)千層金具有較高的耐鹽性，其耐受性可達1.5 dS/m鹽度。Qiu等[12]研究表明當(dāng)扦插基質(zhì)為蛭石時，將千層金枝條在200 mg/L的生根劑中處理3 h后千層金的扦插效果最好。Hou等[13]研究發(fā)現(xiàn)千層金具有較強的干旱忍受能力，在干旱脅迫下能通過增加葉綠素含量來減輕干旱傷害，并且在極度干旱下植株也不會出現(xiàn)死亡。但關(guān)于千層金在鹽堿地種植的生態(tài)適應(yīng)性表現(xiàn)的報道較少，鹽脅迫對千層金精油含量及成分的影響尚未明確。

為探究千層金在鹽堿地的生長情況，本文通過設(shè)置不同鹽濃度梯度，對千層金進行鹽脅迫處理，旨在深入了解鹽脅迫對千層金植株的生理指標(biāo)以及精油含量和成分的影響，為千層金在鹽堿地的種植和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗所選用植物材料為二年生千層金扦插苗，種植于福建農(nóng)林大學(xué)玻璃溫室內(nèi)。選取大小均一，長勢一致，生長健壯，地上部分高約30～40 cm左右的幼苗進行不同濃度鹽脅迫處理。

1.2 實驗設(shè)計

采用100、200、300、400、500 mmol/L的NaCl對千層金進行一個月的鹽脅迫處理，以非鹽脅迫為對照組(CK)。每組5株，設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)，共90盆。每3天每盆澆200 mL的不同濃度的NaCl溶液[14]。

1.3 生理指標(biāo)的測定

參考Zhang[15]的試驗方法，采用乙醇提取法測定光合色素含量，磺基水楊酸法測定脯氨酸含量，硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，比色法測定CAT活性。

1.4 精油提取

參考Yang等[16]的試驗方法，通過水蒸氣蒸餾法提取千層金葉片的精油，稱取50 g采摘的新鮮葉片，置于圓底蒸餾瓶內(nèi)，加入350 mL蒸餾水，持續(xù)蒸餾2 h后收集器中的精油含量無明顯變化，用離心管收集精油，再用無水硫酸鈉干燥后計算精油提取率且得率符合《中國藥典》規(guī)定，不同濃度NaCl處理重復(fù)三次，取平均值。

1.5 千層金葉片精油成分分析

將不同鹽濃度處理下的千層金葉片精油用色譜甲醇進行稀釋，采用Clarus?680+SQ8T型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析不同處理組中的精油成分。利用NIST 2011在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，保留匹配度>700的揮發(fā)性物質(zhì)，通過物質(zhì)的CAS號以及化學(xué)名進行查詢確定。其相對含量采用面積歸一法加以分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Spss statistics 17進行顯著性差異分析；Excel 2007進行表格制作；Origin 2021進行繪圖；通過NIST 2011在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫核對質(zhì)譜匹配度。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對千層金葉片光合色素含量的影響

如圖1所示，在不同NaCl濃度處理下，千層金葉片中葉綠素a與葉綠素含量均低于對照組(CK)，葉綠素b含量在300 mmol/L NaCl處理時達到最大值。而類胡蘿卜素含量則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在100 mmol/L NaCl處理下，千層金葉片中葉綠素a與葉綠素b的比值達到最大值，與CK相比增長12.78%。有研究表明，葉綠素a/b的值越大則光合活性越強[17]。因此，千層金在100 mmol/L NaCl處理下光合活性最強。而在500 mmol/L濃度處理時，葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均達到最低，分別為CK的66.09%和73.84%。由此可見,高濃度的鹽脅迫會降低千層金光合色素含量，影響其光合作用，進而影響植株生長。

2.2 鹽脅迫對千層金脯氨酸含量的影響

由圖2可知，脯氨酸含量呈先下降再上升的趨勢。在100 mmol/L的NaCl處理下，千層金葉片中脯氨酸含量顯著下降，與對照組(CK)相比減少28.08%。在200 mmol/L的NaCl處理下，脯氨酸含量顯著升高(P<0.05)，與CK相比增加了27.59%；表明適宜的鹽濃度可能更有利于千層金植株的生長。當(dāng)NaCl濃度為300～500 mmol/L時，脯氨酸含量雖持續(xù)升高，但無顯著性差異。在高濃度的NaCl處理下會導(dǎo)致植物葉片質(zhì)膜透性增強，造成細胞失水。因此，在300～500 mmol/L NaCl處理下，千層金葉片細胞內(nèi)可能積累大量脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，防止水分流失，以維持植株正常生長。

圖1 不同NaCl濃度下千層金葉片光合色素含量Fig.1 Content of photosynthetic pigment in leaves of M.bracteata under different NaCl concentrations注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05，下同。Note:Different lowercase letters indicated significant differences at P<0.05 level,the same below.

圖2 不同NaCl濃度下千層金葉片脯氨酸含量Fig.2 Proline content in leaves of M.bracteata under different NaCl concentrations

2.3 鹽脅迫對千層金葉片丙二醛含量的影響

由圖3可知，在100～300 mmol/L NaCl處理下，丙二醛含量變化并不顯著，只在300 mmol/L處理時含量降低。當(dāng)NaCl處理濃度提升至400～500 mmol/L時，丙二醛含量顯著上升。此時，千層金葉片嚴重脫落，大部分未脫落葉片呈萎蔫狀態(tài)，只有少部分葉片表形正常，說明高濃度的NaCl處理下葉片損傷嚴重。

圖3 不同NaCl濃度下千層金葉片丙二醛含量Fig.3 Malondialdehyde content in leaves of M.bracteata under different NaCl concentrations

2.4 鹽脅迫對千層金葉片抗氧化酶影響

2.4.1 鹽脅迫對千層金POD活性的影響

過氧化物酶(POD)與植物的多項生理活動密切相關(guān)。由圖4可知，POD活性整體呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)NaCl處理濃度為300 mmol/L和400 mmol/L時，POD活性上升幅度顯著，比對照組(CK)增加了104.08%和72.60%，表明此時千層金植株葉片細胞受損較為嚴重。

圖4 不同NaCl濃度下千層金葉片POD酶活性Fig.4 POD enzyme activity of M.bracteata leaves under different NaCl concentrations

2.4.2 鹽脅迫對千層金CAT活性的影響

過氧化氫酶(CAT)可以分解植物在逆境條件下產(chǎn)生的過氧化，CAT的活性是研究植物抗逆性的重要指標(biāo)。由圖5可以看出，CAT酶活性呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)NaCl濃度為300 mmol/L時，CAT活性最高，與對照組(CK)和其他濃度處理組的差異顯著(P<0.05)且比對照組(CK)增加2.83倍。

圖5 不同NaCl濃度下千層金葉片CAT酶活性Fig.5 CAT enzyme activity of M.bracteata leaves under different NaCl concentrations

2.5 不同濃度鹽處理千層金精油含量和成分分析

2.5.1 不同濃度鹽處理對千層金精油含量的影響

由圖6可知，當(dāng)NaCl處理濃度為100、200 mmol/L時，千層金葉片中精油含量與對照組(CK)相比存在顯著性差異，精油含量與CK相比分別增加22.34%、22.14%。當(dāng)NaCl處理濃度為300 mmol/L時，千層金葉片中精油含量顯著性上升，比CK增加57.83%?？梢娺m當(dāng)?shù)腘aCl處理有助于精油含量的增加。但當(dāng)NaCl處理濃度達到400、500 mmol/L時，千層金葉片嚴重脫落，在生產(chǎn)上也不適宜繼續(xù)提取精油。因此，在適當(dāng)?shù)柠}堿地種植千層金可提高精油產(chǎn)量，千層金栽培過程中也可使用適當(dāng)濃度的NaCl進行培育。

圖6 不同NaCl濃度下千層金精油含量Fig.6 Content of essential oil of M.bracteata under different NaCl concentrations

2.5.2 不同濃度鹽處理千層金葉片精油成分的GC-MS分析

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測，從不同處理組的千層金葉片精油中共鑒定出26種主要的化學(xué)成分，成分分析結(jié)果見表1。通過比較分析，對照組(CK)鑒定出23種精油成分，100～200 mmol/L NaCl處理組鑒定出20種精油成分，而300 mmol/L NaCl處理組只鑒定出19種精油成分。但無論是CK，還是在其他濃度的NaCl處理下，千層金葉片精油中甲基丁香酚的相對含量最高，其次為肉桂酸甲酯，而其他物質(zhì)的相對含量則較低。在200 mmol/L濃度的NaCl處理時甲基丁香酚的相對含量與肉桂酸甲酯的相對含量達到最大值，分別為95.15%和3.57%。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CK與其他鹽脅迫處理組的精油成分存在一定的差異，如在鹽脅迫處理組中未檢測到桉葉油醇與香茅醛。而在100 mmol/L與200 mmol/L濃度NaCl處理中檢測到丁香酚、反式-肉桂酸甲酯、異丁香酚，卻并未在對照組與300 mmol/L濃度NaCl處理中檢測到。同時，在200 mmol/L與300 mmol/L濃度NaCl處理中萜品油烯和α-菖蒲醇也未被檢測到。研究結(jié)果表明不同鹽脅迫處理會使千層金精油的化學(xué)成分存在一定差異，但其主要的香氣成分和相對含量并未有顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

我國鹽堿地面積約9 900萬公頃，當(dāng)大量鹽分在土壤中積累時會使土壤發(fā)生一系列物理性狀的惡化，從而破壞生態(tài)環(huán)境[18]。土壤中過量的鹽分離子會破壞植物細胞結(jié)構(gòu)，形成滲透脅迫效應(yīng)，一些離子可直接毒害于植株，從而引起植物形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致植物無法正常生長。而正常生長環(huán)境下，由于植物體內(nèi)的有害物質(zhì)積累和防御系統(tǒng)之間維持著一個較為平衡的狀態(tài)，因此植株生長的較為健壯。

表1 不同濃度鹽處理千層金葉片精油的成分分析Table 1 Composition analysis of essential oil from leaves of M.bracteata treated with different concentrations of salt

在本試驗中，隨著NaCl濃度的增加，千層金葉片中脯氨酸含量的變化趨勢與耐鹽植物紅海欖(Rhizophorastylosa)在不同濃度鹽脅迫下脯氨酸含量的變化趨勢一致[19]。因此推測適宜的鹽分反而有利于千層金的生長。而丙二醛在低濃度NaCl(100～200 mmol/L)處理下，在千層金葉片內(nèi)的含量變化并不顯著，說明在此濃度下，千層金葉片受到的膜脂過氧化傷害較輕，抗逆性較強，而當(dāng)NaCl濃度在300 mmol/L時，丙二醛含量降低，可能與抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。此后，隨著NaCl濃度的增加，丙二醛含量持續(xù)上升，說明高濃度的NaCl(400～500 mmol/L)對千層金葉片細胞膜的傷害程度逐漸增加，也可表明千層金在此濃度的鹽脅迫下已達到其耐受極限。鹽脅迫下抗氧化性酶的活性變化是植物抗鹽能力的重要指標(biāo)，POD和CAT是研究植物抗逆性的重要內(nèi)容。千層金葉片中POD和CAT的活性在100～400 mmol/L NaCl處理時，均比對照組(CK)高，且在300 mmol/L NaCl處理下達到最大值，可見千層金為抵抗鹽脅迫對其所造成的損害，將根據(jù)不同鹽脅迫的濃度對兩種抗氧化酶做出相應(yīng)調(diào)節(jié)。綜合表明，千層金在鹽脅迫環(huán)境下，能進行自身調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出較好的耐鹽性與抗氧化性。

植物精油具有殺菌、抗氧化和抗炎癥等多種生物活性，是部分植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物。研究表明，玫瑰(RosarugoseThunnb.)植株在50 mmol/L NaCl處理時，其精油的芳香成分最多[20]；而羅勒植株在適當(dāng)?shù)膹?fù)合鹽溶液處理后可以提高精油含量[4]?？梢?，適當(dāng)?shù)柠}脅迫的確會誘導(dǎo)芳香植物精油成分以及含量的變化。本文研究表明，不同濃度NaCl處理對千層金葉片精油的積累有較大的影響，在100～300 mmol/L鹽濃度處理下，精油含量顯著上升，當(dāng)鹽脅迫濃度超出千層金耐受極限時，由于植株的生長發(fā)育受到抑制，導(dǎo)致千層金葉片脫落精油含量下降。因此，千層金植株可通過100～300 mmol/L的NaCl處理提高其精油的產(chǎn)量。有趣的是，雖然千層金在100～300 mmol/L濃度的NaCl處理下，葉片精油含量與CK相比分別增加了22.34%、22.14%和57.83%，但其葉片精油中的成分卻隨鹽脅迫濃度的增加而減少，而精油中的主要成分甲基丁香酚的含量卻無顯著性的變化，可見鹽脅迫雖然使千層金葉片精油中的成分減少，但對其精油品質(zhì)并未造成影響。

綜上所述，在100～300 mmol/L的NaCl處理下，千層金表現(xiàn)出較強的耐鹽性和抗氧化性，不但各項生理指標(biāo)正常，而且葉片精油含量隨濃度增加。因此，千層金有望成為鹽漬地種植的耐鹽植株，不僅可以起到美化環(huán)境、改善鹽漬地生態(tài)環(huán)境的作用，也能提升其精油產(chǎn)量和經(jīng)濟價值。