艾孜提艾力·艾海提，楊 爭，木合布力·阿布力孜，米熱古麗·買買提明，賽力克阿拉·阿里汗，玉蘇普瓦吉木·阿力木江

新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011

宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一,近幾年其發(fā)病率呈現(xiàn)上升態(tài)勢[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在我國宮頸癌患者的病死率以每年3.35%的速度在遞增，10年增長率為29.9%，且年輕人發(fā)病趨勢日益明顯[2]。根據(jù)一項針對近千名女性HPV人乳頭瘤病毒(human papilloma viruses，HPV)篩查結(jié)果可知，感染率為17.46%[3]，可見宮頸癌的預(yù)防及治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前宮頸癌的常規(guī)治療措施為放化療及手術(shù)治療，存在毒副作用大、易發(fā)生腫瘤耐藥及易復(fù)發(fā)等難題[4]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是一類自我更新能力，能夠啟動和驅(qū)動腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移，在腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用的細(xì)胞[5]。CSCs是存在于腫瘤微環(huán)境中的一小部分群體，有研究報道從宮頸癌細(xì)胞中可以鑒定分離出宮頸癌干細(xì)胞(cervical cancer stem cells，CCSCs)[6,7]。腫瘤干細(xì)胞對多數(shù)化療藥物不敏感，是患者在康復(fù)階段導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)的主要原因，嚴(yán)重影響放化療以后的患者2～5年生存率[8]。因此，從天然藥物活性成分中尋找和篩選結(jié)構(gòu)新穎、高抗癌活性、低毒性且具有抑制腫瘤干細(xì)胞活性的抗宮頸癌先導(dǎo)化合物在創(chuàng)新藥物研究中具有較好的深入研究意義。

甘草作為藥食兩用的藥材資源，在我國藥用歷史悠久。雖然甘草存在多種品種，而《中國藥典》(2020年版一部)收錄其原植物有2種，即脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)，其中脹果甘草在新疆南部、甘肅等西北地區(qū)分布資源比較豐富[9]。不同品種的甘草中所含的查爾酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)有所差異。研究證實，查爾酮A(licochalcone A，LicoA)具有抗腫瘤[10]、抗菌[11]、抗炎[12]、保肝[13]、免疫調(diào)節(jié)[14]等作用，而關(guān)于其對宮頸癌相關(guān)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的調(diào)控方面鮮見報道。本課題組在前期基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，改良一種用于治療宮頸糜爛的傳統(tǒng)醫(yī)院制劑，加入了含LicoA的脹果甘草提取物，正在研發(fā)具有預(yù)防宮頸癌潛力并可用于陰道抑菌消炎及宮頸糜爛的陰道泡騰片。在天然有效成分的抗癌活性篩選中發(fā)現(xiàn)，脹果甘草查爾酮成分LicoA對宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡及周期方面具有顯著活性外，且對宮頸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物(Bcl-2、ALDH1A1、OCT-4、UHRF1、BIRC7、BIRC5)基因及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)基因產(chǎn)生明顯的調(diào)節(jié)有用。經(jīng)計算機(jī)輔助藥物設(shè)計法(CADD法)等手段預(yù)測其可能的作用靶點(diǎn)，研究LicoA對以上基因mRNA表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步闡明LicoA對宮頸癌細(xì)胞抗癌活性方面的作用及可能的分子機(jī)制探索提供更充分的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；人子宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa均購買于新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室細(xì)胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Sigma公司，貨號：AF29561079)；胎牛血清(美國Sigma公司，貨號：1644044)；擴(kuò)增試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號：RR047A)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號：RR820A)；RNA提取試劑盒(上海生物工程技術(shù)有限公司，貨號：00170212)。

1.1.2 主要儀器

WRX-4顯微熔點(diǎn)儀(寧波科誠儀器有限公司，中國)；Unity-Inova600超導(dǎo)核磁共振儀(Varian公司，美國)；LTQ-Orbitrap XL賽默飛組合式高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司，美國)；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國)；ZF-7型暗箱三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司，中國)；Heracell CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司，美國)；Multiskan GO酶標(biāo)分析儀(賽默飛世爾科技公司，美國)；BD流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；QuantStudioTM6Flex實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 脹果甘草查爾酮A的制備

取干燥的脹果甘草根粉碎，稱取50.0 g，以料液比(W∶V)為1∶15的95%乙醇中浸泡24 h，45 ℃條件下超聲15 min，80 ℃加熱回流提取2 h，抽濾，得濾液a。濾渣于500 mL的95%乙醇中浸泡過夜，同上述方法處理，得濾液b，合并濾液a、b，45 ℃減壓濃縮，50 ℃干燥。將粗提物用適量30%乙醇溶解上樣于提前處理好的聚酰胺色譜柱，吸附24 h，先水洗3 BV,然后用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇梯度洗脫3 BV，分別收集流分，濃縮，合并具有相同特征的流分，于50 ℃減壓旋蒸并干燥得到總黃酮粉末[15]。

將上述粉末溶解于適量20%乙醇中，上樣于提前備好的AB-8大孔吸附樹脂，吸附24 h，先水洗3 BV，然后30%、50%、60%、70%、80%乙醇各洗脫3 BV，分別收集流分，濃縮，具有相同特征的流分合并，于50 ℃減壓旋蒸干燥后得到總黃酮粉末。稱取總黃酮粉末100 mg，用適量甲醇溶解，于制備薄層板上點(diǎn)樣，以LicoA對照品為對照，以石油醚∶乙酸乙酯=1∶1，加1滴甲酸為展開劑展開，于365 nm紫外光下觀察斑點(diǎn)，標(biāo)記與對照品對應(yīng)的斑點(diǎn)(LicoA具有亮藍(lán)綠色的斑點(diǎn))，干燥后刮去，加甲醇溶解，45 ℃減壓濃縮，50 ℃干燥，得到黃色粉末。之后以硅膠柱層析法純化，石油醚∶乙酸乙酯=2∶1洗脫，收集亮黃色斑點(diǎn)的流分，濃縮，干燥，得到亮黃色粉末，取少量測定其熔點(diǎn)并經(jīng)過1H NMR、13C NMR及HR-EI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取生長狀態(tài)良好的SiHa和HeLa細(xì)胞，用含10%胎牛血清、鏈霉素(100 μg/L)、慶大霉素(100 μg/L)的DMEM完全培養(yǎng)液(pH=7.5)，在37 ℃，5% CO2氧飽合濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行以下各項實驗。

1.2.3 宮頸癌細(xì)胞活力檢測

采用MTT法檢測LicoA對宮頸癌細(xì)胞SiHa、HeLa的增殖抑制活性。取處于對數(shù)生長期的SiHa、HeLa細(xì)胞，以5×104個/mL的密度鋪在96孔板，培養(yǎng)24 h，待96孔中細(xì)胞長至視野的80%左右時，棄去每孔上清液，將濃度為0、10、25、50、75、100 μg/mL的用完全培養(yǎng)基配制的LicoA溶液，按每孔200 μL，每個濃度6個復(fù)孔，加入到96孔板中，以同樣濃度梯度的含順鉑的完全培養(yǎng)液作為陽性對照，只加完全培養(yǎng)液的細(xì)胞懸液為空白對照，分別作用24、48、72 h后加入MTT溶液，用酶標(biāo)儀于490 nm測定吸光度(A)，計算細(xì)胞抑制率，進(jìn)一步用SPSS 26.0軟件分別計算出IC50值。細(xì)胞抑制率=(A空白-A實驗)/A空白×100%。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

根據(jù)LicoA對SiHa、HeLa細(xì)胞的IC50值，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。取對數(shù)生長期細(xì)胞，收集，用細(xì)胞計數(shù)法以每孔細(xì)胞數(shù)為3×105個接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長至視野80%～90%，用完全培養(yǎng)基配制終濃度為0、10、25、50 μg/mL LicoA溶液，分別作用于SiHa、HeLa細(xì)胞24 h后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.2.5 SiHa細(xì)胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期SiHa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入2 mL用完全培養(yǎng)基配置的20 μg/mL的順鉑溶液及濃度為0、10、20、30 μg/mL的LicoA溶液干預(yù)細(xì)胞(根據(jù)“1.2.3”結(jié)果篩選分析得出)，作用24 h后，PBS沖洗并離心，完全棄去上清后每一組分別加100 μL Bingding Buffer(Buffer∶PBS=1∶9配制)輕柔吹打均勻，每組分別加入AnnexinV-和PI各5 μL，室溫避光染色15 min，再每組分別補(bǔ)加400 μL Bingding Buffer混合均勻，經(jīng)300目網(wǎng)篩過濾，上機(jī)檢測。

1.2.6 SiHa細(xì)胞周期檢測

取生長良好的SiHa細(xì)胞，收集、計數(shù)、稀釋成1×105個/mL的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL鋪于6孔板內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入2 mL用完全培養(yǎng)基配置的20 μg/mL的順鉑溶液及濃度為0、10、20、30 μg/mL的LicoA溶液，作用24 h，每孔分別收集上清，加PBS清洗、消化、收集備用。收集好的細(xì)胞各加4～5 mL預(yù)冷的75%乙醇混合均勻，放置4 ℃冰箱固定24 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清，分別加3 mL PBS沖洗3次，棄去上清液，收集細(xì)胞，每組分別加400 μL PI/RNase Staining Buffer混合均勻，室溫避光染色15 min，經(jīng)300目網(wǎng)篩過濾，上機(jī)檢測。

1.2.7 分子對接實驗

1.2.7.1 分子對接參數(shù)

對接個數(shù)(num_modes)是20個，能量范圍(energy_range)是5，可能性構(gòu)象搜尋(exhaustiveness)值為100，除了有特別說明外，其余參數(shù)均采取默認(rèn)值。

1.2.7.2 對接口袋

經(jīng)可能的結(jié)合位點(diǎn)的篩選之后，選擇由CDK4基因所編碼的CDK4蛋白與目標(biāo)單體LicoA進(jìn)行分子對接。由于數(shù)據(jù)庫中未能檢索到有特定配體與之結(jié)合的構(gòu)象，故采用全構(gòu)象對接方式進(jìn)行分析。CDK4(見圖1)，活性口袋的坐標(biāo)為：center_x=-1，center_y=-2，center_z=75；size_x=52，size_y=40，size_z=44。

圖1 CDK4蛋白的對接口袋Fig.1 Docking pocket of CDK4 protein

1.2.8 對宮頸癌相關(guān)腫瘤標(biāo)記物的影響

通過熒光定量RT-PCR法，以β-actin為內(nèi)參，對SiHa細(xì)胞中Bcl-2、ALDH1A1、OCT-4、UHRF1、BIRC7、BIRC5等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA表達(dá)量進(jìn)行測定。取生長良好的SiHa細(xì)胞，收集，計數(shù)，稀釋成1×105個/mL的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL鋪于6孔板內(nèi)，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。每孔加入2 mL用完全培養(yǎng)基配置的濃度為0、10、25、50 μg/mL的LicoA溶液，作用24 h。按照總RNA提取試劑盒(Trizol)的說明書規(guī)范操作，提取SiHa細(xì)胞總RNA，定量并測定其純度后逆轉(zhuǎn)錄得到不同干預(yù)組的cDNA，按說明書加入引物及擴(kuò)增試劑，上PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為TaKaRa擴(kuò)增試劑盒說明書中兩步擴(kuò)增程序，最終得PCR產(chǎn)物并分析結(jié)果。PCR引物序列見下表1。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers

2 結(jié)果

2.1 甘草查爾酮A的結(jié)構(gòu)表征

甘草查爾酮A，黃色粉末，得率0.36%；分子式：C21H22O4；mp.136～137 ℃；HR-EI-MS：m/z339.159 2 [M]+(calcd for C21H23O4，339.159 1)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.31(1H，s，OH-4′)，10.14(1H，s，OH-4)，7.98(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，H-6′)，7.91(1H，d，J=15.6 Hz，H-β)，7.59(1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，7.54(1H，s，6-H)，6.89(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)，6.53(1H，s，H-3)，6.25(1H，s，H-10)，4.94(1H，s，H-11)，3.83(3H，s，ОCH3)，1.46(6H，s，CH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：187.8(s，С=О)，162.1(s，С-4′)，160.2(s，C-2)，158.7(s，C-4)，147.9(s，C-10)，139.2(s，С-β)，131.2(s，C-2′，C-6′)，130.1(s，C-1′)，128.2(s，C-6)，127.0(s，C-5)，118.3(s，C-α)，115.7(s，C-3′，C-5′)，114.0(s，C-1)，110.5(s，C-11)，100.4(s，C-3)，55.9(d，CH3)，40.1(s，C-7)，27.5(d，CH3)。以上1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對比基本一致，確定該成分為甘草查爾酮A(LicoA)，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 LicoA的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 The chemical structure of LicoA

2.2 對宮頸癌細(xì)胞增殖抑制活性

如表2，SiHa、HeLa細(xì)胞分別用0～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)的含LicoA和陽性對照藥順鉑的完全培養(yǎng)基作用24、48、72 h，根據(jù)其抑制率利用SPSS 26.0求相應(yīng)的IC50。陽性藥順鉑分別對兩種細(xì)胞作用24、48、72 h后，對SiHa細(xì)胞的IC50值分別為20.53、7.75、4.49 μg/mL，對HeLa細(xì)胞的IC50值分別為20.71、8.92、5.76 μg/mL；LicoA分別對兩種細(xì)胞作用24、48、72 h后，對SiHa細(xì)胞的IC50值分別為68.38、38.48、24.49 μg/mL，對HeLa細(xì)胞的IC50值分別為39.31、14.91、6.90 μg/mL。

表2 甘草查爾酮A及順鉑對SiHa、HeLa細(xì)胞半數(shù)抑制濃度Table 2 LicoA and Cisplatin to SiHa and HeLa cells

2.3 對細(xì)胞形態(tài)的影響

LicoA對HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響比對SiHa細(xì)胞明顯，10 μg/mL時開始影響HeLa細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，而對SiHa形態(tài)的影響開始于50 μg/mL，10、25 μg/mL時影響不明顯(見圖3)。

圖3 LicoA對2種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(100 μm)Fig.3 Morphological changes of LicoA on two cells (100 μm)

2.4 對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

順鉑在20 μg/mL時對SiHa細(xì)胞作用24 h時的凋亡率為47.60%。與空白組對比，LicoA干預(yù)SiHa細(xì)胞24 h后的促凋亡作用較為顯著。在10～30 μg/mL濃度范圍內(nèi)，LicoA對SiHa細(xì)胞的凋亡率從12.6%增加到52.0%，結(jié)果見表3及圖4。

表3 LicoA對SiHa細(xì)胞作用24 h的凋亡率Table 3 Apoptosisrate of LicoA on SiHa cells for 24

圖4 LicoA和順鉑對SiHa細(xì)胞的凋亡實驗結(jié)果Fig.4 Apoptosis results of LicoA and cisplatin on SiHa cells注：A：空白對照；B：查爾酮A 10 μg/mL；C：查爾酮A 20 μg/mL；D：查爾酮A 30 μg/mL；E：順鉑20 μg/mL；F：圖A～E結(jié)果的統(tǒng)計分析。與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:A:Control;B:LicoA 10 μg/mL;C:LicoA 20μg/mL;D:LicoA 30 μg/mL;E:Cisplatin 20 μg/mL;F:Statistical analysis of A-E.Compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.5 對細(xì)胞周期的影響

陽性藥順鉑在20 μg/mL時對SiHa細(xì)胞作用24 h后，細(xì)胞周期G0/G1期占比為52.55%，S期為35.91%，G2/M期為11.54%；空白組SiHa細(xì)胞在G0/G1期的比值為74.53%，S期為16.19%，G2/M期為8.56%；LicoA在30 μg/mL時，對SiHa細(xì)胞在G0/G1期的比值為43.58%，S期分別為35.18%，G2/M期分別為21.25%；與空白組對比，LicoA在30 μg/mL時SiHa細(xì)胞G0/G1的比值減少了30.95%，S期和G2/M期分別增加了18.99%和12.69%(見表4、圖5)。

表4 LicoA和順鉑對SiHa細(xì)胞周期的影響Table 4 Cell cycle effects of LicoA and cisplatin on

2.6 分子對接實驗結(jié)果

LicoA與CDK4蛋白最低結(jié)合能為-8.6 kcal/mol，選擇打分最高的對接構(gòu)象進(jìn)行具體的結(jié)合模式分析后可知，LicoA能較好地結(jié)合在CDK4形成的結(jié)合口袋內(nèi)。結(jié)合口袋的作用主要含A、B、C三個關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)，LicoA兩側(cè)苯環(huán)一端均插入到CDK4形成的結(jié)合口袋內(nèi)，可以和周圍氨基酸殘基形成作用力，羰基上的氧可與周圍殘基形成部分作用力，LicoA一側(cè)苯環(huán)上的羥基與ASN-145可形成一個2.7 ?的較強(qiáng)氫鍵；羰基上的氧與GLY-15可形成一個2.4 ?的較強(qiáng)氫鍵；A環(huán)上的苯環(huán)與ASP-158可形成Pi-陰離子作用(見圖6)。

圖5 LicoA對SiHa細(xì)胞周期的影響Fig.5 Cell cycle effects of LicoA on SiHa注：a：空白對照；b：查爾酮A 10 μg/mL；c：查爾酮A 20 μg/mL；d：查爾酮A 30 μg/mL；e：順鉑20 μg/mL。Note:a:Control;b:LicoA 10 μg/mL;c:LicoA 20μg/mL;d:LicoA 30 μg/mL;e:Cisplatin 20 μg/mL.

圖6 LicoA和CDK4的結(jié)合模式Fig.6 Binding mode of LicoA and CDK4

2.7 對宮頸癌腫瘤標(biāo)記物mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖7所示，LicoA在濃度為50 μg/mL條件下作用于SiHa細(xì)胞24 h后，周期相關(guān)基因CDK-4的相對表達(dá)量下調(diào)至0.012；Bcl-2、ALDH1A1、OCT-4、UHRF1、BIRC7、BIRC5等基因的相對表達(dá)量隨著LicoA干預(yù)濃度的提高，分別出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)。與空白對照組(0 μg/mL)相比，干預(yù)組(25、50 μg/mL)SiHa細(xì)胞各基因mRNA表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

目前，臨床上對于宮頸癌的治療措施仍以外科手術(shù)切除為主，配合化療和放療輔助治療。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出對宮頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療做出了新的詮釋。研究證實，腫瘤干細(xì)胞既是腫瘤細(xì)胞放化療耐受的根源所在，也是引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的原因之一[17]。因此，利用天然活性成分，安全有效的干預(yù)腫瘤干細(xì)胞，從而降低宮頸癌的發(fā)病可能及預(yù)防治療后宮頸癌的復(fù)發(fā)是一個新的研究方向。

圖7 不同濃度LicoA干預(yù)SiHa細(xì)胞后各基因相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of genes after intervention of different concentrations of LicoA in SiHa 注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01.

目前研究證實，甘草具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、保肝、免疫調(diào)節(jié)等作用。新疆地區(qū)脹果甘草資源豐富，甘草查爾酮A成分主要分布于其根莖中。本課題組在前期研究中開發(fā)和建立脹果甘草中查爾酮A的檢測鑒定系統(tǒng)并申報了一項儀器裝備相關(guān)的實用新型專利(專利號：ZL201721685479.2)，在此基礎(chǔ)上提取并制備了LicoA成分。LicoA抗腫瘤的機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但關(guān)于其對宮頸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的調(diào)控作用的研究較為少見。本研究結(jié)果顯示，新疆脹果甘草查爾酮A對宮頸癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，能夠誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞凋亡并且可能阻滯細(xì)胞周期于S期和G2/M期，并對宮頸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物具有顯著下調(diào)作用。

在正常情況下，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)與細(xì)胞周期的G1期的E2F轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物并被抑制。CDK4能磷酸化Rb復(fù)合物導(dǎo)致E2F的釋放，以轉(zhuǎn)錄細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期所必需基因，而沒有這種磷酸化活性的情況下細(xì)胞阻滯在G1期[18]，本研究中CDK4基因在甘草查爾酮A濃度為25、50 μg/mL時被顯著抑制。干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1和OCT4在宮頸癌及其前體病變中表達(dá)上調(diào)，特別是在外周血中表達(dá)上調(diào)，提示ALDH1A1和OCT4可作為生物標(biāo)志物用于早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌或監(jiān)測患者的治療[19]。ALDH1A1參與視黃醇在細(xì)胞質(zhì)中氧化成視黃酸的過程，而視黃酸又被轉(zhuǎn)入細(xì)胞核并啟動參與早期干細(xì)胞分化的基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞增殖[20，21]。八聚體結(jié)合蛋白4(OCT-4)是一種在胚胎和成體干細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞增殖、分化、多能性和自我更新有關(guān)，在胚胎干細(xì)胞中敲除OCT-4會導(dǎo)致其分化及干細(xì)胞特性消失[22]。甘草查爾酮A也能使以上2種標(biāo)記物(ALDH1A1、OCT4)的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)。此外，本研究所篩選的Bcl-2、UHRF1、BIRC7、BIRC5等均為宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)的腫瘤標(biāo)記物[23]，其mRNA表達(dá)量也均被甘草查爾酮A不同程度地下調(diào)，提示新疆脹果甘草查爾酮A成分可能具有良好的預(yù)防宮頸癌復(fù)發(fā)的研究潛力。