劉佳利，任 維,2，楊思進(jìn),2，湯 潤(rùn)，毛琳慎，稅丕先*

1西南醫(yī)科大學(xué)；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，瀘州 646000

卒中是造成我國(guó)國(guó)民減壽的第一病因，嚴(yán)重危害國(guó)民健康，影響全民健康水平。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及國(guó)民生活水平的提高，腦卒中的發(fā)病率逐年上升且日趨低齡化。根據(jù)發(fā)病類型的不同，腦卒中又分為缺血性卒中與出血性卒中。缺血性卒中又名腦梗死，有數(shù)據(jù)表明，在我國(guó)缺血性卒中人群約占卒中總?cè)藬?shù)的85%[1]。因此，如何減少腦梗死發(fā)病率、致殘率、死亡率、恢復(fù)神經(jīng)功能是目前中西醫(yī)學(xué)者共同關(guān)注的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

目前，西醫(yī)對(duì)腦梗死的治療手段主要為靜脈溶栓、動(dòng)脈溶栓和機(jī)械取栓三種，能為患者短期內(nèi)重建病灶血運(yùn)、緩解缺氧損傷、減少自由基產(chǎn)生等做出積極貢獻(xiàn)[2]。但部分患者遠(yuǎn)期預(yù)后較差，面臨后遺癥、并發(fā)癥等問(wèn)題。中醫(yī)藥治療腦梗死具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其適用范圍廣、副作用小、患者預(yù)后好并能提高神經(jīng)功能恢復(fù)、降低病殘率與復(fù)發(fā)率、提高患者生活質(zhì)量。中醫(yī)認(rèn)為腦梗死病因病機(jī)與氣虛血瘀、痰瘀阻竅等有關(guān)，隨著對(duì)中風(fēng)及“毒邪”的深入認(rèn)識(shí)與研究，有學(xué)者提出了“中風(fēng)熱毒論”“毒損腦絡(luò)”等觀點(diǎn)，認(rèn)為中風(fēng)后產(chǎn)生的痰毒、熱毒等均可損傷腦絡(luò)[3]。大血藤為木通科大血藤Sargentodoxacuneata(Oliv.) Rehd.Et Wils植物的干燥藤莖，具有清熱解毒、活血通經(jīng)、祛風(fēng)除濕等功效，并含有豐富的化學(xué)成分，如皂苷類、蒽醌類、有機(jī)酸類、木質(zhì)素類、酚類等。常用于治療腸癰腹痛、熱毒瘡瘍、經(jīng)閉、痛經(jīng)、跌撲腫痛、風(fēng)濕痹痛等[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大血藤能改善腦海馬和皮質(zhì)區(qū)的損傷，可抑制微循環(huán)灌注量的下降從而減小梗死區(qū)域面積占比，降低死亡率[4]。大血藤總酚酸可抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織炎癥反應(yīng)、抑制腦細(xì)胞凋亡，同時(shí)，可降低腦缺血再灌注損傷大鼠的死亡率、降低神經(jīng)功能缺失評(píng)分[5]。通竅化栓方是臨床治療腦梗死的有效組方，其中大血藤為君藥，該方主治功能核心為祛風(fēng)、祛痰、祛瘀。Cai等[6]臨床研究結(jié)果表明，通竅化栓湯可明顯改善缺血性腦卒中患者的血液流變學(xué)指標(biāo)，可改善血液的黏稠度、凝固性及細(xì)胞聚集性，具有理想的抗栓作用。目前，對(duì)于大血藤作用于心腦血管疾病的有效成分、作用靶點(diǎn)、作用通路等仍處于探索階段，使得研發(fā)利用及臨床推廣受到了一定限制。因此，本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析大血藤的化學(xué)成分，闡明其有效成分作用于腦梗死疾病的治療靶點(diǎn)及作用通路，為深入研究大血藤治療腦梗死提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Ultimate 3000超高效液相色譜儀(含自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)、低壓四元梯度泵、PDA檢測(cè)器)，美國(guó)Waters公司；LTQ Orbitrap velos pro高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司。大血藤飲片購(gòu)自四川金方生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：170987，產(chǎn)地：四川。表兒茶素、紅景天苷(純度均>98%)購(gòu)自賽百草科技有限公司(北京，中國(guó))，批號(hào)SH19052904、19042901；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(HPLC級(jí))，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；超純水，美國(guó)Millipore 公司；其他試劑均為分析純。

1.2 大血藤提取物溶液制備

中藥大血藤，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)中藥學(xué)教授稅丕先鑒定為正品。大血藤粉碎，過(guò)3號(hào)篩。取粉末10 g，加8倍量無(wú)水乙醇，超聲提取0.5 h(250 W，40 kHz)，冷卻至室溫，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次提取操作，合并上清液A。濾渣加10倍量水超聲提取1 h(250 W，40 kHz)。冷卻至室溫，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)提取兩次，合并上清液B備用。上清液A、B合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍真空干燥，獲得大血藤提取物。精密稱取大血藤粉末1 g，置于25 mL錐形瓶中，加入75%甲醇20 mL，精密稱定，超聲提取1 h，冷卻后用75%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻。以0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品待測(cè)液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取表兒茶素、紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.00 mg，分別置于5.00 mL量瓶中，加適量甲醇稀釋，定容至刻度，配成濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。檢測(cè)前用甲醇稀釋儲(chǔ)備液10倍，待測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱：HSS T3柱(1.8 μm，2.1 mm ID × 150 mm，Waters)；35 ℃柱溫；樣品盤(pán)溫度4 ℃；流動(dòng)相A：水(含0.1%甲酸)；B：乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脫條件：0～5 min，2% B；5～8 min，2%→20% B；8～45 min，20%→55% B；45～52 min，55%→100% B；52～58 min，100% B；58～58.5 min，100%→2% B；58.5～65 min，2% B；進(jìn)樣量3 μL，流速0.2 mL/min。

1.5 質(zhì)譜條件

對(duì)于高分辨質(zhì)譜LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀，電噴霧(ESI)離子源參數(shù)設(shè)定如下：負(fù)離子掃描和正離子掃描模式，加熱器溫度為300 ℃，毛細(xì)管溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為35 V，噴霧電壓為± 3.5 kV，鞘氣(N2)流速為35 arb，輔助氣(N2)流速為10 arb；樣品一級(jí)質(zhì)譜分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描(分辨率R為60 000，m/z掃描范圍為100～1 500)，二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描(data dependent scan，DDS)。數(shù)據(jù)采集和分析采用Xcalibur，Mass Frontier 7.0軟件。

1.6 預(yù)測(cè)大血藤活性成分的靶點(diǎn)

利用中藥分子機(jī)理生物信息學(xué)分析工具(Swiss Target Prediction)，針對(duì)鑒定出的大血藤活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)計(jì)算與匹配，選擇Probability≥0.05的靶點(diǎn)作為候選基因。

1.7 獲得腦梗死的疾病治療靶標(biāo)

以“Cerebral ischemia”“Cerebral infarction”等相關(guān)詞段為關(guān)鍵詞和搜索條件，在2個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，http://www.omim.org/；GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，https://www.genecards.org/)中進(jìn)行檢索，檢索出腦梗死疾病在數(shù)據(jù)庫(kù)中的疾病靶點(diǎn)并去除重復(fù)基因，獲得腦梗死疾病的蛋白靶點(diǎn)。

1.8 分析“大血藤-潛在靶標(biāo)-腦梗死”蛋白質(zhì)相互作用并構(gòu)建拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

利用String數(shù)據(jù)庫(kù)，將成分和疾病交集的靶標(biāo)進(jìn)行檢索處理，物種設(shè)置為“Homo sapiens(人類)”，最低相互作用閾值設(shè)置為0.9，其余默認(rèn)，得到靶標(biāo)蛋白間的相互作用信息。將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并使用其中的Network Analyzer計(jì)算拓?fù)鋮?shù)，以betweenness centrality、closeness centrality、degree三個(gè)參數(shù)的中值為閾值以篩選大血藤治療腦梗死的核心靶點(diǎn)。

1.9 識(shí)別功能模塊、注釋生物學(xué)信息、分析富集通路

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行g(shù)ene ontology(GO)與KEGG分析，根據(jù)P<0.05篩選得出排列前二十位的生物過(guò)程(biological progress，BP)、細(xì)胞成分(cell component，CC)、分子功能(molecular function，MF)及KEGG結(jié)果，并使用R語(yǔ)言軟件進(jìn)行結(jié)果可視化操作。

1.10 采用分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇相互作用網(wǎng)絡(luò)中degree值靠前的5個(gè)靶點(diǎn)，選取其相應(yīng)的化學(xué)成分，在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載化合物結(jié)構(gòu)，并從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得所對(duì)應(yīng)蛋白復(fù)合物的3D結(jié)構(gòu)。利用軟件Discovery Studio 2019中的CDOKCER方法，使用半柔性分子對(duì)接方法，導(dǎo)入蛋白及化合物結(jié)構(gòu)后，使其能量最小化，并進(jìn)行加氫、去水等操作，選取活性位點(diǎn)、去除原始配體，構(gòu)建分子對(duì)接模型，并分析對(duì)接結(jié)果。以結(jié)合能(-CDOKCER interaction energy，-CIE)>0為界，值越大，提示二者間相互作用能越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 大血藤主要化學(xué)成分

將大血藤供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液按上述條件下的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行UPLC-HR-MS分析，得到正、負(fù)離子模式下的總離子流圖(typical total ion chromatograms，TICs，見(jiàn)圖1)，響應(yīng)均良好。利用Xcalibur Qual Browser軟件，對(duì)正、負(fù)離子模式下采集的大血藤提取物進(jìn)行分析，根據(jù)化合物正負(fù)離子模式下的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、同位素豐度、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確認(rèn)，結(jié)合碎片信息、標(biāo)準(zhǔn)品裂解規(guī)律及已有文獻(xiàn)報(bào)道，共鑒定及推測(cè)得到大血藤提取物中化合物共20種(見(jiàn)表1)，包括苯丙素類、蒽醌類、酚酸類、三萜類等。其中酚酸類12種，苯丙素類4種，蒽醌類3種，三萜類1種。20種化合物中，表兒茶素和紅景天苷為通過(guò)對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)，有一級(jí)及二級(jí)碎片的13個(gè)化合物為根據(jù)其二級(jí)碎片及裂解規(guī)律及文獻(xiàn)比對(duì)確認(rèn)，沒(méi)有碎片峰的5個(gè)化合物為根據(jù)其一級(jí)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)、同位素豐度及與文獻(xiàn)比對(duì)確認(rèn)。

圖1 正(A)、負(fù)(B)離子檢測(cè)模式下的大血藤總離子流圖Fig.1 TICs of Sargentodoxa cuneata in the positive(A) and negative(B) ion mode

表1 大血藤提取物UPLC-HR-MSn數(shù)據(jù)Table 1 UPLC-HR-MSn in the positive and negative ion mode data of the compounds detected in S.cuneata

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 大血藤化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

共篩選活性化合物19種，包括酚酸類化合物如紅景天苷、原兒茶酸、沒(méi)食子酸、羅布麻寧、丁香酸葡萄糖苷，苯丙素類化合物如綠原酸、N-反式阿魏酰酪胺，蒽醌類化合物大黃素、大黃酚，甾體類化合物如胡蘿卜苷，三萜皂苷類如齊墩果酸等。這些化合物有耐缺氧、抗炎等藥理作用，提示篩選的成分與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。并從Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)中共匹配預(yù)測(cè)到相關(guān)靶點(diǎn)393個(gè)。

2.3 疾病靶標(biāo)的預(yù)測(cè)

通過(guò)OMIM及GeneCards兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得3 288個(gè)腦梗死疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.4 “活性成分-靶點(diǎn)”的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

取上述兩者的交集，作為大血藤治療腦梗死的潛在靶點(diǎn)，輸入至String數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(見(jiàn)圖2)，得到266個(gè)蛋白、1 073條互作連線的蛋白網(wǎng)絡(luò)，并將分析結(jié)果導(dǎo)入至Cytoscape軟件中，構(gòu)建大血藤的“活性成分-靶點(diǎn)”(見(jiàn)圖3)，該網(wǎng)絡(luò)由285個(gè)節(jié)點(diǎn)和908條邊構(gòu)成，紅色“V”形為大血藤活性化合物，藍(lán)色矩形為潛在靶點(diǎn)。并依據(jù)betweenness centrality、closeness centrality、degree三個(gè)參數(shù)，共篩選出核心靶點(diǎn)71個(gè)，包括PIK3CA、SRC、STAT3等。并按照degree對(duì)19種活性成分進(jìn)行排序，發(fā)現(xiàn)二氫愈創(chuàng)木脂酸、大黃酚、紫羅蘭酮苷、大黃素甲醚排在前列(見(jiàn)表2)。

2.5 GO富集分析

GO富集分析分為三個(gè)模塊，即生物過(guò)程BP，MF和CC。BP顯示靶基因主要集中在肽基酪氨酸磷酸化及自磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation、peptidyl-tyrosine autophosphorylation)、血小板激活(platelet activation)、上調(diào)細(xì)胞增殖(positive regulation of cell proliferation)、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(phosphatidylinositol-mediated signaling)、酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)等(見(jiàn)圖4)。

MF主要與α2-腎上腺素能受體活動(dòng)(alpha2-adrenergic receptor activity)、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合(growth factor receptor binding)、血小板活化因子受體活性(platelet activating factor receptor activity)等有關(guān)(見(jiàn)圖5)。

圖2 核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The core target network of S.cuneata for cerebral ischemia

圖3 大血藤化合物-靶點(diǎn)圖Fig.3 “Ingredient-target network” of S.cuneata注：紅色為大血藤活性化合物，藍(lán)色為各個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。Note:The red section is on behalf of the S.cuneata compounds,the blue section represents prediction targets.

表2 排名前20大血藤治療腦梗死的核心靶點(diǎn)拓?fù)湫畔able 2 Topological information of the top 20 core targets in the treatment of cerebral infarction by S.cuneata

CC主要由分選內(nèi)體(sorting endosome)、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物(phosphatidylinositol 3-kinase complex)、內(nèi)體腔(endosome lumen)、偽足(pseudopodium)等組成(見(jiàn)圖6)。

圖4 核心靶點(diǎn)的GO-BP富集分析Fig.4 GO-BP enrichment analysis on core targets

圖5 核心靶點(diǎn)的GO-MF富集分析Fig.5 GO-MF enrichment analysis on core targets

圖6 核心靶點(diǎn)的GO-CC富集分析Fig.6 GO-CC analysis on core targets

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，大血藤對(duì)腦梗死的藥理作用涉及通路包括缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、神經(jīng)鞘脂類(sphingolipid)、響應(yīng)胰島素、ErbB、FOXO、催乳素(prolactin)、雌激素(estrogen)等生物信號(hào)通路(按P值排序，見(jiàn)圖7)。

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

采用PIK3CA、SRC、APP、MAPK3、STAT3的分子對(duì)接模型與大血藤成分進(jìn)行對(duì)接(見(jiàn)表3)，共對(duì)接22對(duì)。根據(jù)對(duì)接分值，選取排名前三進(jìn)行分析。

3，4-二羥基苯乙醇葡萄糖苷與APP主要以以下方式結(jié)合：與A鏈的GLY-11、THR-72、ARG-128、ILE-126、ASP-32形成氫鍵，與A鏈的LYS-107、PHE-108、SER-35、TYR-185形成碳?xì)滏I，與A鏈的TYR-71形成π-烷基鍵。紫羅蘭酮苷與PIK3CA主要以以下方式結(jié)合：與A鏈的ARG-1770、SER-1774、ASP-1933、LYS-1776、LYS-1802形成氫鍵，與A鏈的MET-1772形成烷基，與A鏈的MET-1922形成二硫鍵。紫羅蘭酮苷與STAT3主要以以下方式結(jié)合：與A鏈的ASP-181、ARG-221、ARG-254、ARG-24、ASP-48形成氫鍵，與A鏈的ILE-219、MET-258形成烷基(見(jiàn)圖8)。

表3 小分子與靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接結(jié)果Table 3 The docking result of small molecules with targets

3 討論與結(jié)論

通過(guò)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)圖中對(duì)度值排名前5的成分：二氫愈創(chuàng)木脂酸、大黃酚、紫羅蘭酮苷、胡蘿卜苷、大黃素甲醚進(jìn)行成分分析。二氫愈創(chuàng)木脂酸對(duì)血小板活化因子受體結(jié)合有阻斷作用，從而防止血小板凝集造成血栓的形成[18]。大黃酚可能通過(guò)抑制Bax蛋白表達(dá)水平，減少Beclin1蛋白產(chǎn)生，減輕神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[19]。胡蘿卜苷神經(jīng)保護(hù)作用與上調(diào)抗氧化蛋白，抑制P38絲裂原活化蛋白酶、應(yīng)激活化蛋白激酶信號(hào)通路的活化有關(guān)。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜苷具有促神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用[20]。大黃素甲醚可通過(guò)降低IL-1β、TNF-α、ICAM-1的表達(dá)，抑制Caspase-3的活性，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[20]。

圖8 分子對(duì)接模型Fig.8 Molecular docking model注：A：綠原酸甲酯-APP；B：大血藤苷E-PIK3CA；C：大血藤苷E-STAT3。Note:A:3,4-Di-O-caffeoylquinic acid methyl ester-APP;B:Cuneataside E-PIK3CA;C:Cuneataside E-STAT3.

根據(jù)篩選出的71個(gè)核心靶點(diǎn)，并對(duì)PIK3CA、Src、STAT3、JAK2等degree值較大的靶點(diǎn)進(jìn)行文獻(xiàn)分析。PIK3CA是PI3K/Akt/mTOR途徑的中心分子，與細(xì)胞增殖、血管生成和腫瘤發(fā)生有關(guān)。有研究表明，PIK3CA蛋白在OGD/R(氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo))的SH-SY5Y(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)和腦組織中的表達(dá)明顯受到抑制，激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，可有效提高PIK3CA表達(dá)水平從而減少線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]。星形膠質(zhì)細(xì)胞(Src)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細(xì)胞，在腦梗死發(fā)生后，其能激活成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，并形成膠質(zhì)瘢痕。有研究表明Src是Ang II誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的上游信號(hào)，其中Src可激活ERK1/2來(lái)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，在腦損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。JAK2/STAT3的激活與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。有研究表明，JAK2作為STAT3的上游信號(hào)分子，其能調(diào)節(jié)STAT3的磷酸化，從而介導(dǎo)STAT3激活的下游生物反應(yīng)。JAK磷酸化抑制劑可降低缺血大腦組織中JAK2和STAT3磷酸化水平，從而降低細(xì)胞凋亡率，縮小梗死面積[23]。HSPs是因受有害刺激后細(xì)胞產(chǎn)生的一種應(yīng)激蛋白，與腫瘤的產(chǎn)生、增殖及分化有關(guān)。有研究報(bào)道，HSP90α能在一定程度上保護(hù)缺氧神經(jīng)細(xì)胞，并提高細(xì)胞耐缺氧能力，為半暗帶內(nèi)的血管再生爭(zhēng)取了時(shí)間[24]。綜上，預(yù)測(cè)的核心靶點(diǎn)參與了腦梗死的發(fā)病機(jī)制，分析結(jié)果與大血藤、腦梗死等相關(guān)報(bào)道較為一致，推測(cè)大血藤化學(xué)成分可通過(guò)作用于這些核心靶點(diǎn)，從而發(fā)揮潛在的治療機(jī)制。

通過(guò)KEGG富集分析結(jié)果可知，大血藤可能通過(guò)HIF-1信號(hào)通路、sphingolipid信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等發(fā)揮防治腦梗死的作用。其中HIF-1信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧狀態(tài)的主要分子，其在細(xì)胞低氧狀態(tài)時(shí)較敏感[25]。目前已發(fā)現(xiàn)HIF途徑可直接刺激活化近80種基因，其誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)主要表現(xiàn)為提高缺氧細(xì)胞耐受力和存活力。Sphingolipid(神經(jīng)鞘脂類)在神經(jīng)生長(zhǎng)分化過(guò)程中具有重要地位，外源性神經(jīng)鞘脂類已被證實(shí)具有廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用，其能發(fā)揮腦保護(hù)作用，并促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)等。有研究顯示，靜脈溶栓后配合神經(jīng)鞘脂類注射液比單行靜脈溶栓術(shù)的神經(jīng)功能恢復(fù)更好。在衰老過(guò)程和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過(guò)程中，大腦中的神經(jīng)酰胺水平會(huì)逐漸增加，并介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮修復(fù)作用[26]。NRG/ErbB信號(hào)通路在腦梗死的保護(hù)作用機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，在受到創(chuàng)傷的大腦組織中，神經(jīng)細(xì)胞里的NRG-1β及ErbB受體會(huì)被誘導(dǎo)。ErbB信號(hào)能拮抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的產(chǎn)生，保護(hù)大腦神經(jīng)元。還有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可以通過(guò)調(diào)節(jié)NRG/ErbB通路，提高ErbB的表達(dá)水平，在一定程度上抑制神經(jīng)元的凋亡及炎癥因子的釋放與表達(dá)，還可抑制單核細(xì)胞浸潤(rùn)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后與細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用[27]。上述幾條通路主要參與了氧化應(yīng)激過(guò)程、神經(jīng)修復(fù)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過(guò)程，可進(jìn)一步推測(cè)大血藤化學(xué)成分可通過(guò)調(diào)節(jié)這些通路發(fā)揮治療腦梗死的作用機(jī)理。此外，分子對(duì)接的結(jié)果，初步模擬了成分與靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，在一定程度上驗(yàn)證了上述預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性[28]。

綜上，本研究通過(guò)結(jié)合UPLC-HR-MS、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接等方法，對(duì)大血藤化學(xué)成分及治療腦梗死的作用靶點(diǎn)、生物通路進(jìn)行了研究與分析，構(gòu)建了化學(xué)成分靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系并進(jìn)行了驗(yàn)證。多方位闡釋了大血藤通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路機(jī)制發(fā)揮治療腦梗死疾病的作用機(jī)制，且相關(guān)預(yù)測(cè)與文獻(xiàn)報(bào)道相符，為未來(lái)深入研發(fā)大血藤治療腦梗死的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)與證據(jù)。